奶牛和禽源H5N1病毒可诱发泌乳山羊严重乳腺炎并传播至哺乳羔羊

本刊推荐：研究人员针对高致病性禽流感A(H5N1)病毒在反刍动物中的传播风险开展研究，通过实验感染泌乳山羊发现，奶牛源和禽源clade 2.3.4.4b H5N1病毒均可引起严重乳腺炎，病毒通过乳汁传播至哺乳羔羊。研究证实山羊乳腺细胞表达α2,3和α2,6唾液酸受体，凸显了反刍动物作为H5N1病毒潜在宿主的重要性，强调加强家畜监测的必要性。

　　

当高致病性禽流感H5N1病毒开始跨越物种屏障，从鸟类传播到哺乳动物时，科学界拉响了警报。最近在美国奶牛中爆发的疫情尤其令人担忧，这些病毒不仅感染了奶牛，还传播到了其他动物甚至人类。更令人意外的是，在明尼苏达州的山羊中也检测到了H5N1病毒，这标志着该病毒在反刍动物中的传播出现了新的发展。这些事件引发了一系列关键问题：H5N1病毒如何感染反刍动物？它们能否在物种间传播？最重要的是，这对动物和人类健康构成什么风险？

为了解决这些问题，加拿大食品检验署国家外来动物疾病中心的Tamiru N. Alkie、Carissa Embury-Hyatt、Anthony V. Signore等研究人员在《Cell Reports》上发表了一项重要研究。他们深入探讨了H5N1病毒在泌乳山羊中的感染机制和传播动态，特别是关注了病毒如何通过乳腺组织感染并传播给哺乳期的幼崽。

研究人员使用了两种不同基因型的H5N1病毒：从德克萨斯州奶牛分离的B3.13基因型病毒（Cow-H5N1）和从土耳其秃鹫分离的B1.2基因型病毒（TuVu-H5N1）。通过结合呼吸道和乳腺接种途径，他们模拟了农场中可能发生的自然感染情况。研究团队随后监测了病毒感染后的临床表现、病毒传播情况以及免疫反应，同时还进行了深入的细胞水平研究，探索病毒在山羊呼吸道和乳腺细胞中的复制能力。

研究采用了多种关键技术方法：包括病毒分离培养与滴定、实时定量RT-qPCR检测病毒RNA、免疫组织化学和原位杂交分析病毒分布、血清学检测中和抗体、新一代测序分析病毒变异，以及建立山羊原代呼吸道上皮细胞和乳腺上皮细胞培养模型（样本来源为未感染的健康山羊）。

临床 presentation of A(H5N1) infection in goats

研究人员发现，两种H5N1病毒都能引起山羊发热，体温超过40°C，并出现鼻腔分泌物和腹泻等临床症状。感染山羊还表现出乳房肿胀和严重的乳腺炎症状。值得注意的是，TuVu-H5N1病毒感染组出现更频繁的发热和更明显的临床症状。

Intramammary infection: Impact on milk yield and mastitis development

两组感染山羊的产奶量均急剧下降，在感染后2天内迅速减少，并在整个14天的实验期内没有恢复。乳汁质地也发生显著变化，从最初的粘稠状态转变为乳清样或黄油样 consistency，并可见凝块或凝乳。加州乳腺炎测试(CMT)显示强烈阳性反应。

Viral RNA detection in the mucosal surfaces of lactating goats and suckling kids

通过基质基因实时RT-qPCR检测，在所有感染山羊的鼻腔拭子中检测到病毒RNA，Ct值在31-35之间。在口腔拭子中也检测到病毒RNA，尽管水平较低。从一只Cow-H5N1感染山羊的口腔拭子中成功分离出传染性病毒。在羔羊中，口腔拭子的病毒RNA检测比鼻腔拭子更常见，表明通过摄入含病毒的乳汁发生暴露。

Viral shedding in goat milk: Quantification and temporal dynamics

病毒滴定和RT-qPCR结果显示，两种病毒在乳汁中的病毒滴度相当，TuVu-H5N1组在整个研究期间保持较高的传染性病毒滴度，在2-4天 post-infection(dpi)达到10^10 TCID50/mL的峰值。病毒RNA在乳汁样本和乳腺组织中持续检测到，直到14 dpi。

Tissue distribution and viral persistence in lactating goat

对3和6 dpi安乐死山羊的组织分析显示，病毒RNA在多种组织中检测到，包括肺部和乳腺上淋巴结。在胃肠道或生殖组织（子宫）中也检测到病毒RNA。TuVu-H5N1感染山羊的脑样本中检测到病毒RNA和传染性病毒。两种病毒在乳腺 gland中的RNA水平异常高，Ct值为16.25-17.12。

Histological and molecular analysis of mammary and pulmonary tissues

组织学分析显示，Cow-H5N1和TuVu-H5N1病毒感染山羊的乳腺组织均出现广泛坏死性乳腺炎，特征包括上皮细胞坏死、退化的多形核细胞在乳腺泡腔内积聚以及乳腺泡退化。免疫组织化学和原位杂交证实了病毒在乳腺组织中的广泛复制。肺部病理变化较轻，表现为自限性轻度呼吸道感染，在两个感染组中均观察到局灶性坏死性间质性肺炎和血管周围袖套现象。

Sialic acid receptor distribution and virus-colocalization in goat tissues

通过植物凝集素组织化学分析发现，山羊乳腺上皮细胞中α2,3-linked唾液酸（禽型受体）的表达高于α2,6-linked唾液酸（人型受体）。免疫荧光分析显示，IAV核蛋白与α2,3-linked唾液酸共定位，而与α2,6-linked唾液酸几乎没有共定位。

Replication of A(H5N1) viruses in goat primary respiratory and mammary epithelial cells

体外实验显示，TuVu-H5N1病毒（携带PB2-D701N突变）在所有呼吸道上皮细胞类型中均表现出比Cow-H5N1和猪源H1N1病毒更强的复制能力。在鼻上皮细胞中，两种病毒复制到相似滴度，但TuVu-H5N1在24小时 post-infection(hpi)时滴度高一个log10。在支气管上皮细胞中，TuVu-H5N1在24 hpi时就显示出显著更高的复制效率，到48 hpi时滴度高达9 log10 TCID50/mL。在山羊原代乳腺上皮细胞中，TuVu-H5N1和Cow-H5N1病毒均能有效复制，TuVu-H5N1在24 hpi时达到峰值滴度。

Antibody detection in sera, milk, and BAL fluid

两组感染山羊及其接触羔羊都产生了系统性（血清）和黏膜（呼吸道和乳腺）抗H5N1抗体。通常血清中的病毒中和抗体水平高于经凝乳酶处理的乳汁样本。在BAL液中也检测到升高的H5N1特异性抗体。TuVu-H5N1在大多数样本类型（血清、乳汁和BAL）中诱导了相对更强的抗体反应。

Sequence analysis

通过对从2-3只感染山羊纵向收集的乳汁样本中的A(H5N1) RNA进行新一代测序(NGS)，评估了病毒在乳腺中复制后变异的出现。数据显示，在3、6和10 dpi收集的乳汁样本中，存在0到11个核苷酸多态性。这些突变在感染早期获得，且在接种物中不存在。两种病毒都保持了其典型的标记残基：Cow-H5N1中的PB2-M631L和TuVu-H5N1中的PB2-D701N。

该研究得出结论，山羊对H5N1病毒感染高度易感，特别是乳腺组织表现出明显的病毒嗜性。病毒通过乳汁排泄导致哺乳羔羊感染，证实了哺乳途径传播的重要性。研究发现山羊乳腺和呼吸道组织表达α2,3和α2,6唾液酸受体，这为病毒入侵提供了分子基础。值得注意的是，禽源和奶牛源的H5N1病毒都能在山羊中引起严重疾病，表明clade 2.3.4.4b病毒具有更广泛的乳制品病原体潜力。

这些发现具有重要意义：首先，它们强调了反刍动物作为H5N1病毒潜在宿主的重要性，需要加强家畜监测计划；其次，研究结果对公共健康具有启示，因为食用未经巴氏消毒的感染山羊乳汁可能带来人畜共患病传播风险；最后，山羊作为H5N1病毒感染模型具有价值，可用于研究病毒 pathogenesis 和疫苗效力测试。随着HPAI在奶牛中的持续爆发和具有哺乳动物适应性突变的新基因型的出现，将泌乳山羊或绵羊纳入HPAI监测计划似乎是明智之举。

研究的局限性包括使用组合暴露途径、样本量有限、特定病毒株选择以及相对较短的观察期，未来研究可通过单一路径接种、剂量依赖性研究和延长研究期来提供更全面的理解。尽管如此，这项研究为我们理解H5N1病毒在反刍动物中的传播机制和潜在风险提供了重要见解，对制定有效的防控策略具有重要指导意义。