单细胞分析揭示人类CD8+调节性T细胞的两个新亚群及其差异化转录组特征

为解决CD8+调节性T细胞(Tregs)表型异质性和缺乏共识标记的问题，研究人员通过单细胞RNA测序(scRNA-seq)结合CITE-seq和TCR-seq技术，首次在健康人外周血中鉴定出HELIOS+和TNFR2+两个功能迥异的CD8+ Tregs亚群。研究发现TNFR2+CD29low亚群具有强效抑制功能，并通过独立数据集验证了发现，为CD8+ Tregs的临床转化提供了关键分子标志和理论依据。

　　

在免疫学的广阔图景中，调节性T细胞(Tregs)犹如维持机体稳态的精密卫士，其中CD4⁺ Tregs因Foxp3的发现而备受瞩目，其临床应用已步入临床试验阶段。然而，早在1970年代就被发现的CD8⁺ Tregs却长期笼罩在迷雾之中。它们虽被证明具有强大的免疫抑制能力，甚至在某些方面优于CD4⁺ Tregs，但其惊人的表型异质性和公认表面标记的缺失，极大地阻碍了对其生物学特性的深入解析和临床转化应用的步伐。就像一个拥有巨大潜力的宝藏，却因缺乏可靠的地图而难以发掘。特别是在器官移植和自身免疫性疾病领域，如何精准调控免疫反应、避免传统免疫抑制剂的毒副作用，是当前面临的主要挑战。CD8⁺ Tregs能够通过识别广泛表达的MHC I类分子直接与靶细胞相互作用，这使其在移植耐受中具有独特优势，但前提是我们必须真正了解它们是谁，以及如何精确地找到并利用它们。

为了解决这一难题，由Carole Guillonneau研究员领导的研究团队在《iScience》上发表了最新成果。他们利用最前沿的单细胞多组学技术，首次对健康人外周血中的CD8⁺ T细胞进行了高精度的深度解析，旨在揭示CD8⁺ Tregs的真实面貌，为其最终走向临床应用绘制出关键性的“细胞地图”。

研究人员为开展本研究，主要应用了以下几项关键技术：从4名健康志愿者外周血中分离CD8⁺ T细胞；采用10x Genomics平台的5′单细胞RNA测序(scRNA-seq)技术，同时整合了CITE-seq（胞胚索引转录组测序，使用30种表面抗体）和TCR-seq（T细胞受体测序）进行多组学分析；利用Seurat软件包进行生物信息学聚类和差异基因表达分析；通过体外抑制实验功能验证关键Tregs亚群的免疫抑制能力；并使用一个包含约6万个细胞的独立公共scRNA-seq数据集对研究结果进行验证。

Two subsets of regulatory CD8+ T cells with differential transcriptome revealed by single cell analysis

研究首先通过scRNA-seq和CITE-seq对四名健康供体外周血新鲜分离的CD8⁺ T细胞进行了分析。研究共分析了7517个细胞，通过无监督聚类识别出10个不同的细胞亚群，包括幼稚T细胞（高表达SELL、CCR7）、中央记忆T细胞（CM）、效应记忆T细胞（EM1, EM2, EM3）等。关键的是，通过CD45RC蛋白的表达，成功将具有潜在促炎特性的CD45RC^high细胞群（主要位于簇0、5、7）与具有潜在调节特性的CD45RC^low/-细胞群（簇1-4, 6, 8-9）区分开来，这与团队之前的研究完全一致。

Characterization of two CD8+ T cell subsets exhibiting distinct regulatory signatures

深入分析CD45RC^low/-群体后，研究发现了两个具有截然不同转录特征的调节性T细胞亚群。簇8高表达转录因子IKZF2（编码HELIOS蛋白），而簇2则完全不表达HELIOS，但高表达TNFRSF1B（编码TNFR2蛋白）和ITGB1（编码CD29蛋白）。这两个亚群在关键基因表达上形成鲜明对比：HELIOS⁺亚群（簇8）特征性地表达ZNF683、FUT7、KLRC3等基因；而TNFR2⁺亚群（簇2）则高表达FGFBP2、CX3CR1、FCGR3A以及效应分子GZMB、GZMH等，呈现一种激活和分化的状态。

HELIOS and CD8 coexpression defines a distinct effector memory CD8+ Treg subset

对HELIOS⁺ CD8⁺ Tregs（簇8）的进一步分析表明，该亚群富集了与免疫系统负调控、淋巴细胞分化、抗原处理等相关的通路。其表面标志物特征（如表达IL2RB、CXCR3、TIGIT、FCRL6，不表达GZMA/GZMH）支持其具有效应记忆表型和调节功能，而非细胞毒性功能。

Coexpression of TNFRSF1B and ITGB1 defines a subset of induced CD8+ Treg

对TNFR2⁺ CD8⁺ Tregs（簇2）的分析则揭示了其独特的“诱导”特征。该亚群显示出与T细胞激活、增殖和免疫效应过程相关的通路富集。其表达谱（低表达IL7R、SELL、CD27，高表达ZEB2、TBX21、ITGB2、TGFBR3等）表明这是一个高度分化、适应性激活的Treg群体，可能是在外周由抗原驱动诱导产生的。

Reduced TCR repertoire diversity and differential chain usage in TNFR2+CD8+ Tregs compared to HELIOS+CD8+Tregs

TCR分析揭示了两个亚群在克隆结构上的根本差异。TNFR2⁺亚群表现出显著的TCR多样性降低和克隆扩增，并且其TRAV和TRBV基因的使用存在明显偏向性（如偏向使用TRAV1-2和TRBV20-1），CDR3区还存在特定的氨基酸序列 motif（如ERD, DTE）。这些特征强烈暗示该亚群的发育是抗原驱动的。相比之下，HELIOS⁺亚群则保持了高度多样化的多克隆TCR库，提示其可能更像一种天然的、由胸腺选择的Treg群体。

TNFR2 contributes to the functional activity of TNFR2+CD29lowCD8+ highly suppressive Tregs

研究的核心发现之一是通过功能实验证实了TNFR2作为关键表面标志物的价值。流式细胞术分析证实，在CD8⁺CD45RC^low/- T细胞中，可以根据TNFR2和CD29的表达进一步细分出四个亚群。体外抑制实验令人信服地证明，从健康供体血液中分选出的TNFR2⁺亚群，特别是TNFR2⁺CD29^low细胞，表现出极其强大的抑制同种异体CD4⁺效应T细胞增殖的能力，其效果显著优于总体的CD8⁺CD45RC^low/- T细胞。通过使用TNFR2阻断抗体和TNFR2特异性激动剂（TNC-scTNF(143N/145R)）进行的干预实验进一步表明，TNFR2的信号传导直接参与了该亚群抑制功能的发挥。

Confirmation of CD8+ Treg transcriptional and TCR signatures in an independent dataset

为了确保研究结果的可靠性和普适性，团队在一个独立的公共scRNA-seq数据集（包含约6万个细胞）中进行了验证。分析结果成功地复现了最初的发现：在未参与本研究的其他健康个体中，同样存在转录谱高度相似的HELIOS⁺和TNFR2⁺ CD8⁺ Tregs亚群（分别对应公共数据集中的簇5和簇4）。更重要的是，TNFR2⁺亚群在公共数据集里也表现出TCR多样性降低和克隆优势，而HELIOS⁺亚群则保持多克隆性，这从独立的数据源有力地支持了本研究提出的“TNFR2⁺亚群为抗原诱导产生”的假说。

本研究通过高精度的单细胞多组学分析，彻底改变了我们对人类CD8⁺调节性T细胞的认识。它首次明确揭示了在健康人外周血中存在着至少两种功能特性截然不同的CD8⁺ Tregs亚群：一种可能是胸腺来源的、以表达HELIOS为特征、拥有多样TCR库的亚群；另一种则是以外周诱导生成为主、以表达TNFR2为特征、呈现寡克隆扩增且抑制功能极强的亚群。研究不仅提供了迄今为止最全面的人类CD8⁺ Tregs分子图谱，更重要的是鉴定出了TNFR2和CD29这两个关键表面标志物，能够用于富集功能最强的抑制性细胞亚群。

这一发现具有多重深远意义。首先，它解决了该领域长期存在的表型异质性问题，为后续的机制研究和免疫监测提供了可靠的分子工具。其次，TNFR2⁺CD29^low亚群强大的抑制功能为其作为细胞治疗产品提供了直接依据，而TNFR2作为可操作的靶点，既可以通过激动剂抗体在体内扩增和增强Tregs功能，也可能用于在体外制备更优的细胞治疗产品。最后，研究揭示了这两种亚群可能在不同的病理生理情境下扮演不同角色（如移植耐受、感染免疫、自身免疫等），这将指导未来开发更具针对性的免疫干预策略。总之，这项研究为将CD8⁺ Tregs的基础生物学知识转化为临床应用奠定了坚实的基石，有望在未来为移植排斥、自身免疫性疾病等带来新的治疗希望。