近交系蝾螈基因组揭示行为、发育与再生分子机制

本研究针对蝾螈巨大基因组测序难题，通过长读长测序技术完成20Gb近交系西班牙肋突螈基因组组装，鉴定出蝾螈特异的卫星DNAPwa-ST-Bam，发现Bmp4和Myod基因缺失现象，揭示Shh基因增强子MFCS1/ZRS在5Mb距离外仍保持功能调控，并发现与肢体再生相关的顺式作用元件，为两栖动物进化发育和再生医学研究提供关键基因组资源。

　　

在生物医学研究领域，蝾螈等有尾两栖动物因其非凡的器官再生能力而备受关注。自Spallanzani于1768年发现蝾螈再生现象以及Spemann和Mangold发现组织者现象以来，这些动物一直是发育生物学和再生医学研究的重要模型。然而，蝾螈拥有巨大的基因组大小（西班牙肋突螈约20Gb，墨西哥钝口螈达32Gb），这给基因组测序和分子生物学研究带来了巨大挑战。近年来，虽然墨西哥钝口螈和非洲肺鱼等巨大基因组的染色体级别组装相继完成，揭示了转座元件（TEs）扩张是基因组巨大的主要原因，但缺乏其他有尾两栖动物高质量基因组数据，限制了我们对有尾目两栖动物基因组特征和再生机制的全面理解。

西班牙肋突螈（Pleurodeles waltl）作为一种新兴模式生物，在生理学、发育生物学、生殖生物学和再生生物学研究中展现出独特优势。即使在变态后，这种蝾螈仍保持多种身体部位（包括四肢和内脏器官）的高再生能力，且易于饲养，约一年即可性成熟，非常适合通过基因编辑进行反向遗传学研究。为了建立P. waltl作为生物学研究模型，并增强我们对蝾螈进化和多样性的理解，研究人员长期致力于该物种的基因组资源开发。

近期，研究团队利用HiFi长读长测序技术对实验室近交系（F8代）西班牙肋突螈进行了基因组测序和组装，获得了20.24Gb的基因组草图。该基因组杂合度极低（约0.07%），组装质量较高（N50为60.53Mb），覆盖了96.1%的核心脊椎动物基因。重复序列分析显示，73.3%的基因组由转座元件组成，主要以LTR/Gypsy、DNA/Harbinger和DNA/hAT为主。研究发现Hoxd11-d13基因间区扩展超过1Mb，其中插入了大量重复序列，包括新发现的蝾螈特异性卫星DNAPwa-ST-Bam。

研究团队通过荧光原位杂交（FISH）技术发现，Pwa-ST-Bam散布于所有染色体的着丝粒和近着丝粒区域，占基因组的4.3%。与日本火蝾螈的Cyp-ST-Bam卫星DNA有80.9%同源性，与光滑蝾螈的TVm8有73.9%同源性，但在其他脊椎动物基因组中未发现明显同源序列。

研究还发现蝾螈发育相关基因存在独特的丢失现象。Bmp4（骨形态发生蛋白4）基因在蝾螈中完全缺失，而该基因在脊椎动物发育中通常参与中胚层诱导。Myod（肌源性决定因子）基因也在蝾螈中缺失，该基因是肌肉分化的主要调节因子。这些基因丢失可能通过改变TGF-β信号通路和肌肉分化过程，增强蝾螈的再生能力。

研究发现Nkx2.9和Nkx3.3这两个转录因子在蝾螈胚胎发育中高表达，可能参与咽弓及其衍生物（如颌和鳃）的形成。Somatolactin（Sl）基因（生长激素/催乳素家族成员）在蝾螈中保留，而在无尾目和蚓螈中丢失，该基因可能通过体色调节影响生殖行为。

在生殖行为相关基因方面，研究发现Sodefrin Precursor-like Factor（SPF）基因家族在西班牙肋突螈中存在至少18个拷贝，但这些基因的C端缺乏加工位点（K/R），不能像冠螈属那样产生十肽信息素sodefrin。这与两种蝾螈不同的求偶行为相一致：冠螈雄性通过摇尾传播信息素，而西班牙肋突螈雄性采用抱合（amplexus）方式。

研究还发现，尽管基因组巨大化导致保守非编码元件（CNEs）与基因体之间的距离增加，但蝾螈中重要的发育调控功能仍然保持。特别是Shh基因的肢体增强子MFCS1/ZRS，虽然与Shh基因启动子相距约5Mb（是其他脊椎动物的5倍），仍能精确调控Shh表达，执行肢体发育程序。

更重要的是，研究团队在MFCS1/ZRS区域发现了一个与肢体再生相关的顺式作用元件。通过CRISPR-Cas9技术构建的MFCS1/ZRS突变体蝾螈，虽然肢体发育正常，但再生肢体出现指趾缺失（从前肢四指变为三指）。该区域与哺乳动物中最近报道的REX（Range EXtender） motif（[C/T]AATTA）相对应，可能通过结合同源盒转录因子，在再生过程中促进基因重新激活。

研究采用的主要技术方法包括：使用HiFi长读长测序技术对近交系西班牙肋突螈进行基因组测序；通过k-mer分析和BUSCO评估评估基因组组装质量；利用RepeatModeler和RepeatMasker进行重复序列注释；采用荧光原位杂交（FISH）技术分析卫星DNA的染色体分布；通过比较基因组学和系统发育分析研究基因丢失和保留现象；使用CRISPR-Cas9技术构建基因突变体；通过RNA-seq和TSS-seq技术分析基因表达谱。

Genomic features and statistics of the incipient inbred P.waltl

研究通过对近交系蝾螈进行HiFi测序，获得了20.24Gb基因组组装，发现基因组重复序列比例高达73.3%，主要為LTR和DNA转座子。鉴定出蝾螈特异性卫星DNAPwa-ST-Bam，占基因组的4.3%，并通过FISH证实其分布在所有染色体的着丝粒和近着丝粒区域。

Gene repertoire unique to the salamander developmental program

研究发现蝾螈中Bmp4和Myod基因缺失，这可能是其增强再生能力的分子基础。同时发现所有Hox基因簇基因，包括Hoxc1和Hoxb13，揭示了与两栖动物进化相关的不对称基因丢失模式。

Reproductive behavior gene repertoires in the salamanders

研究发现西班牙肋突螈保留somatolactin（Sl）基因，可能通过体色调节影响生殖行为。SPF基因家族存在多个拷贝，但缺乏C端加工位点，不能产生十肽信息素sodefrin，这与它们的抱合求偶行为相一致。

Balancing evolutionary constraints and genome expansion in salamanders

研究发现尽管基因组巨大化导致调控元件与基因距离增加，但Shh基因的肢体增强子MFCS1/ZRS在5Mb距离外仍能精确调控基因表达。在MFCS1/ZRS区域鉴定出一个与肢体再生相关的顺式作用元件，突变该元件会导致再生肢体缺陷。

研究结论表明，西班牙肋突螈基因组的解析为了解有尾两栖动物的进化、发育和再生提供了关键见解。基因组巨大化主要由转座元件扩张驱动，但不同蝾螈谱系的转座元件组成存在差异。蝾螈特异的发育基因丢失（如Bmp4和Myod）可能与其强大的再生能力相关。生殖行为相关基因的共选择（如SPF基因家族）反映了求偶行为的多样化进化。尽管基因组巨大化导致调控距离增加，但通过拓扑关联结构域（TADs）和REX motif等机制，重要的发育调控功能得以保持。发现的再生相关顺式作用元件为理解器官再生的分子机制提供了新线索。

该研究的重要意义在于提供了高质量近交系蝾螈基因组资源，为比较基因组学和进化发育生物学研究提供了重要数据。基因丢失现象的研究为理解再生能力的进化提供了新视角。生殖行为相关基因的分析揭示了性信息素系统的多样化进化。调控机制的研究为理解巨大基因组如何维持精确的基因调控提供了新见解。再生相关元件的发现为再生医学研究提供了潜在靶点。西班牙肋突螈作为一种成熟快、适合基因操作的模型生物，将有力推动器官再生分子机制的研究。