RGD修饰藻酸盐多孔微载体封装间充质干细胞滴眼液治疗NOD小鼠自身免疫性干眼病的研究

本刊推荐：为解决自身免疫性干眼病(DED)治疗中干细胞递送效率低、存活差的问题，研究人员开发了RGD修饰藻酸盐多孔微载体封装MSCs(RGD-Alg@MSCs)滴眼液。研究证实该系统能显著增强MSCs存活与免疫调节功能，延长眼表滞留时间，有效抑制DC成熟和TH17分化，显著改善NOD小鼠泪液分泌、角膜修复及炎症浸润，为DED治疗提供了创新性细胞递送平台。

　　

干眼病(Dry Eye Disease, DED)是一种常见的眼部疾病，全球数百万人受其困扰。它不仅表现为泪液分泌不足，更伴随着慢性炎症和眼表组织损伤，导致眼部不适、视力障碍，严重影响生活质量。尤其自身免疫相关的干眼病，如干燥综合征(Sj?gren’s Syndrome, SS)所引发的干眼，病情更为顽固，现有治疗方法如人工泪液、抗炎药物等往往只能暂时缓解症状，无法从根本上逆转免疫异常和组织损伤。

在这一背景下，干细胞治疗为DED带来了新希望。间充质干细胞(Mesenchymal Stem/Stromal Cells, MSCs)具有强大的免疫调节和组织修复能力，能够抑制炎症因子释放、调节免疫细胞活性，并促进受损组织再生。然而，如何将MSCs有效递送至眼表并维持其存活与功能，成为制约其临床应用的瓶颈。传统静脉注射方式只有极少量细胞能到达眼部，而直接眼内注射又具有侵入性，且眼表动态环境（如眨眼和泪液流动）会使常规细胞滴眼液迅速清除，治疗效果大打折扣。

为此，研究人员将目光投向了水凝胶微载体技术。水凝胶具有良好的生物相容性和可定制性，能模拟细胞外基质环境，为细胞提供庇护所。但传统水凝胶缺乏多孔结构，限制了营养扩散和细胞与环境的物质交换。微流控电喷雾技术的出现，使得制备大小均一、结构可控的多孔微载体成为可能，为干细胞输送提供了新思路。

在这项发表于《SCIENCE ADVANCES》的研究中，研究人员开发了一种新型MSCs封装多孔微载体滴眼液系统，用于治疗自身免疫性干眼病。他们通过精妙的材料设计和工艺优化，成功构建了RGD肽修饰的藻酸盐多孔微载体，并封装MSCs形成RGD-Alg@MSCs滴眼液。该系统不仅显著提升了MSCs的存活率和功能维持，还延长了其在眼表的滞留时间，在体外和体内实验中均展现出卓越的治疗效果。

研究主要采用了微流控电喷雾技术制备微载体，通过核磁共振(¹H NMR)和傅里叶变换红外光谱(FTIR)验证材料合成，扫描电镜(SEM)观察微观结构，流式细胞术分析细胞表型和功能，RNA测序(RNA-seq)进行转录组分析，并利用NOD小鼠模型进行体内疗效评估。人角膜上皮细胞(HCECs)和来自人外周血单核细胞(PBMCs)的树突状细胞(DCs)及T细胞用于体外机制研究。

结果部分

RGD-藻酸盐的合成与表征

通过EDC/NHS偶联化学将RGD肽接枝到藻酸盐上，成功合成了RGD-Alg。¹H NMR光谱显示精氨酸残基的特征峰，FTIR光谱证实酰胺键形成，表明RGD成功修饰。细胞实验表明RGD修饰显著促进了细胞粘附。

多孔RGD-Alg微载体的制备

采用微流控电喷雾技术，优化电压、流速和溶液浓度等参数，制备出粒径约130 μm、单分散性良好的多孔微载体。PEO作为致孔剂，溶解后形成 interconnected 的多孔结构，便于物质交换。

多孔RGD-Alg微载体的力学和流变学特性

微载体的杨氏模量约为50 kPa，表现出柔软的弹性特性，适合眼部应用。流变学测试显示其具有剪切稀化行为，粘度在30-300 mPa·s的理想范围内，与常见滴眼液相似，确保了使用的舒适性和滞留时间。

多孔RGD-Alg微载体的生物相容性

提取物实验证实微载体对HCECs和MSCs均无毒性，细胞存活率超过95%。封装在微载体中的MSCs存活率高，增殖显著，且能很好地维持干性标志物(CD105、CD90、CD73阳性，CD45、CD34、CD11b、CD19阴性)表达。

RGD-Alg@MSCs的稳定性

4°C储存24小时后，微载体形态保持完整，封装MSCs的存活率(83.6%)显著高于直接悬浮的MSCs(69.3%)，证明微载体系统对细胞具有保护作用。

RGD-Alg@MSCs的体外效应

在高渗模型中，RGD-Alg@MSCs能显著提高HCECs存活率，减少细胞凋亡和活性氧(ROS)水平，降低TNF-α、IL-6、IL-1β等促炎因子mRNA表达。ELISA检测显示，RGD-Alg@MSCs释放TSG-6、CCL-20、IDO和PGE₂等免疫调节因子的水平显著高于传统MSCs。

MSCs和HCECs共培养的转录组分析

RNA-seq发现，与常规MSCs相比，RGD-Alg@MSCs处理的HCECs中有79个独特上调和1087个独特下调的差异表达基因(DEGs)。GO和KEGG分析显示，这些基因显著富集于细胞迁移、细胞间信号传导(p53和FoxO通路)，以及炎症反应(JAK-STAT、MAPK、NF-κB通路)的负调控等。MSCs本身的转录组也发生改变，RGD-Alg@MSCs中T细胞免疫调节、细胞粘附等功能相关基因上调，TNF信号通路下调。

DED小鼠模型中RGD-Alg@MSC滴眼液的治疗效果

在NOD小鼠模型中，RGD-Alg@MSC治疗显著增加了泪液分泌，降低了角膜荧光素染色评分，提高了结膜杯状细胞密度，减少了角膜和结膜中促炎细胞因子的mRNA表达。H&E染色显示，治疗组泪腺和哈德氏腺中的淋巴细胞浸润显著减轻。

RGD-Alg@MSCs对DCs和T_H17分化的体外免疫调节作用

与RGD-Alg@MSCs共培养后，LPS诱导的成熟DCs表面标志物HLA-DR、CD86、CD83和CD40的表达显著降低。这些经处理的DCs进一步与初始CD4⁺ T细胞共培养时，诱导T_H17(CD4⁺IL-17A⁺)分化的能力明显减弱。

RGD-Alg@MSCs的体内免疫调节作用

体内实验表明，RGD-Alg@MSC滴眼液治疗显著降低了NOD小鼠角膜中DCs的密度和树突复杂性，减少了角膜和引流淋巴结(dLNs)中T_H17细胞的比例，同时抑制了dLNs中DCs的数量和成熟度(以CD45⁺CD11c⁺MHC-II⁺和CD45⁺CD11c⁺CD86⁺细胞为指标)。

结论与讨论

本研究成功开发了一种基于RGD修饰藻酸盐多孔微载体的MSCs封装滴眼液系统，用于治疗自身免疫性干眼病。该系统通过微流控电喷雾技术制备，具有优异的生物相容性、适宜的力学性能和流变学特性，以及显著增强的细胞保护作用。

研究结果表明，RGD-Alg@MSCs不仅能有效缓解高渗应激下角膜上皮细胞的损伤，抑制炎症反应，还能通过独特的转录组重编程机制，增强MSCs的免疫调节功能。在NOD小鼠模型中，该滴眼液系统显著改善了干眼症状，包括增加泪液分泌、促进角膜修复、恢复结膜杯状细胞和抑制泪腺炎症浸润。其核心作用机制在于高效抑制树突状细胞成熟和T_H17细胞分化，从而打破自身免疫性干眼病的炎症循环。

与现有DED疗法相比，RGD-Alg@MSCs滴眼液具有诸多优势：非侵入性给药方式提高患者依从性；多孔微载体结构延长眼表滞留时间；RGD修饰增强细胞粘附与存活；3D微环境维持干细胞干性与功能；强大的免疫调节能力针对疾病根本机制。

该研究不仅为自身免疫性干眼病提供了创新治疗策略，也建立了一个可扩展的细胞扩增和递送平台，对于其他眼部表面疾病乃至需要局部细胞治疗的疾病都具有重要的借鉴意义。未来研究可进一步优化制剂配方、探索长期疗效评估、并推动临床转化研究，让这一创新技术惠及更多患者。