植物抗病毒新机制：MC4-La1切割模块通过R-motif介导的防御mRNA翻译抑制病毒感染

为揭示植物抗病毒免疫新机制，研究人员聚焦于半胱氨酸蛋白酶metacaspase 4（MC4）与RNA结合蛋白La1的互作，发现BSMV病毒感染激活MC4切割La1，促进其胞质定位并增强R-motif介导的cap非依赖性防御mRNA翻译，而病毒γb蛋白通过抑制MC4自加工拮抗该通路。该研究首次阐明了MC4-La1模块通过翻译重编程调控抗病毒免疫的机制，为作物抗病育种提供了新靶点。

　　

植物在面对病毒侵袭时演化出了复杂的免疫机制，然而关于蛋白酶如何调控抗病毒免疫的过程仍不明确。特别是半胱氨酸蛋白酶metacaspase（MC）家族在植物抗病中的作用多集中于细菌和真菌感染，其在病毒免疫中的功能尚未被揭示。同时，病毒入侵往往导致宿主翻译机制的全局抑制，但植物如何选择性翻译防御相关mRNA以适应病毒攻击，也是当前研究的空白点。此外，尽管已知purine-rich element（R-motif）在模式触发免疫（PTI）中介导cap非依赖性翻译，但其在抗病毒免疫中的功能仍属未知。

为了回答这些问题，研究人员以模式植物本氏烟（Nicotiana benthamiana）和大麦条纹花叶病毒（Barley stripe mosaic virus, BSMV）为系统，综合运用分子生物学、生物化学和遗传学等方法，结合病毒学、细胞生物学及生物信息学分析，深入解析了MC4-La1模块在抗病毒免疫中的功能及其调控机制。研究首次发现病毒感染可激活MC4并通过切割La1蛋白触发防御mRNA的翻译重编程，且这一过程被病毒效应子γb所拮抗。该成果发表于《SCIENCE ADVANCES》，为植物抗病毒机制提供了全新视角。

主要关键技术方法包括：TurboID邻近标记技术筛选病毒蛋白互作组；体内/外蛋白酶切割实验验证底物加工；双分子荧光互补（BiFC）和免疫共沉淀（Co-IP）分析蛋白互作；核质分离与荧光定位观察蛋白亚细胞动态；双荧光素酶报告系统检测R-motif介导的翻译效率；病毒诱导基因沉默（VIGS）和转基因植物表型分析；AlphaFold2预测蛋白互作界面。

MC4在BSMV感染中发挥抗病毒作用

通过系统发育分析鉴定本氏烟中6个metacaspase旁系同源物，发现Ⅱ型metacaspase MC4（NbMCA-IIa）与BSMVγb蛋白存在互作。功能实验表明，过表达MC4显著抑制BSMV积累，而催化失活突变体MC4_C139A无此效应。利用RNA干扰（RNAi）和CRISPR-Cas9敲除技术构建MC4缺陷植株，发现病毒复制增强。免疫印迹证实BSMV感染诱导MC4自我加工（self-processing），且该过程依赖Ca²⁺信号，表明MC4是病毒感染的负调控因子。

MC4与La1互作并在R448位点切割La1

通过BiFC和Co-IP验证MC4与RNA结合蛋白La1的相互作用。体内外切割实验证明MC4特异性切割La1，生成约70 kDa的片段（La1_1-448），且该过程需蛋白酶活性及Ca²⁺参与。点突变实验确定切割位点为La1第448位精氨酸（R448），该位点在植物中高度保守。亚定位显示全长La1定位于细胞核，而切割后的La1_1-448易位至细胞质，提示切割改变其功能定位。

La1切割是其抗病毒功能所必需的

La1缺陷植株接种BSV后病毒积累增加，而过表达La1则抑制病毒感染。在MC4敲除背景下，La1过表达无法发挥抗病毒作用，表明La1功能依赖MC4介导的切割。进一步发现，仅野生型La1和截短体La1_1-448具有抗病毒活性，而模拟未切割突变体La1_R448E则无效。病毒感染诱导内源La1切割片段积累，且La1核质转位依赖于MC4活性。

病毒 infection 激活R-motif介导的cap非依赖性防御mRNA翻译

利用双荧光素酶报告系统，发现BSMV感染显著增强含有TBF1 mRNA 5′先导序列（LsTBF1）中R-motif元件的翻译效率，而突变R-motif（LsTBF1_mR3）则消除该效应。双顺反子报告实验进一步证实R-motif具有内部核糖体进入位点（IRES）活性。TBF1沉默植株对BSMV、甜菜黑色焦枯病毒（BBSV）、黄瓜花叶病毒（CMV）和番茄黄化曲叶病毒（TYLCV）均更敏感，而过表达TBF1则增强抗性，表明R-motif介导的翻译是广谱抗病毒机制。

切割后的La1增强R-motif介导的翻译

RNA pull-down实验显示BSMV感染后La1与R-motif结合增强。La1过表达促进R-motif报告基因翻译，而在La1缺陷植株中病毒诱导的翻译激活受阻。截短体La1_1-448比全长La1更显著提升翻译效率。在MC4敲除植株中，La1无法增强翻译，且BSMV诱导的翻译重编程消失，证明MC4-La1模块通过调控R-motif依赖性翻译强化免疫应答。

γb靶向MC4抑制其自我加工以促进病毒感染

BSMV编码的γb蛋白与MC4直接互作，且该互作依赖于γb第31位谷氨酸（E31）。突变γb_E31A减弱互作强度，并导致病毒毒力下降。在γb过表达植物中，MC4自我加工和La1切割被抑制。感染γb缺陷病毒（BSMV_mγb）后MC4活化水平更高。体外实验显示γb以剂量依赖方式抑制MC4对La1的切割。在大麦中沉默HvMC4或HvLa1同源基因同样增强BSMV感染，表明该机制在单双子叶植物中保守。

MC4-La1模块调控广谱抗病毒免疫

在MC4敲除和La1缺陷植株中，CMV、BBSV和TYLCV的积累均显著增加，症状加剧，证明MC4-La1通路是植物应对多种病毒的核心防御机制。

研究结论与意义：

本研究发现了一条全新的植物抗病毒信号通路：病毒感染通过Ca²⁺信号激活MC4，进而切割La1蛋白，促使La1_1-448转位至细胞质，增强与R-motif的结合并促进防御mRNA的cap非依赖性翻译，从而有效抑制病毒复制。另一方面，病毒效应蛋白γb通过直接结合MC4抑制其自我加工，阻断La1切割和后续免疫应答，为病毒逃逸宿主防御提供了新策略。该研究不仅首次揭示了metacaspase在抗病毒免疫中的关键作用，还阐明了翻译重编程作为植物免疫核心环节的机制，为利用基因编辑或育种技术增强作物广谱抗病性提供了分子靶点（如MC4、La1_R448切割位点及R-motif序列）。此外，研究所建立的MC4激活检测体系、R-motif翻译报告系统及γb互变体病毒为植物病毒学提供了重要工具。