空间解析嵌合分析揭示胶质母细胞瘤利用前沿星形胶质细胞的ATP促进其浸润性生长

为解析胶质母细胞瘤(GBM)浸润性生长的分子机制，研究人员开发了空间解析嵌合分析工具SCAR，发现浸润性GBM细胞在星形胶质细胞富集的前沿区域上调CKB表达，通过催化细胞外ATP和肌酸转化为磷酸肌酸提供代谢支持，cyclocreatine可阻断该过程，为靶向治疗提供新策略。

　　

胶质母细胞瘤(Glioblastoma, GBM)作为最具侵袭性的原发性脑肿瘤，其治疗面临巨大挑战。尽管手术可以切除肿瘤主体，但浸润到周围脑组织的肿瘤细胞常常导致治疗抵抗和复发。这些浸润细胞与脑细胞之间的相互作用机制尚不明确，部分原因在于缺乏有效区分肿瘤细胞与肿瘤微环境(tumor microenvironment, TME)细胞的空间技术工具。传统方法如免疫组化(immunohistochemistry)和单细胞RNA测序(scRNA-seq)虽能提供一定信息，但要么通量低，要么会破坏组织空间结构，限制了对细胞空间互作的深入理解。近年来出现的空间解析转录组学(spatially resolved transcriptomics)、蛋白质组学(proteomics)和代谢组学(metabolomics)技术为研究肿瘤-TME相互作用提供了新机遇，然而这些方法仍在通量与细胞分辨率间存在权衡，数据往往代表混合的细胞类型和状态，需要计算推断。

在这项发表于《SCIENCE ADVANCES》的研究中，研究人员通过结合人鼠嵌合GBM模型的空间解析谱分析和改进的计算工作流程，开发了空间解析嵌合分析工具(Spatially-resolved Chimeric AnalyzeR, SCAR)，实现了肿瘤与微环境谱系的高特异性和高灵敏度区分。利用这一工具，团队在空间背景下以增强的分辨率表征了浸润性GBM细胞，并证明CKB在GBM细胞的前沿区域上调，进而分泌到细胞外空间利用星形胶质细胞提供的ATP和肌酸(creatine, Cr)，促进GBM的浸润性生长。

研究主要采用了以下关键技术方法：通过10X Visium空间转录组测序分析GSC异种移植模型和TP53/NF1/PTEN三基因敲除(TNP)人神经干细胞(hNSC)异种移植胶质瘤模型；利用SCAR工具进行物种特异性转录本区分和定量；使用免疫荧光(immunofluorescence, IF)进行蛋白表达验证；通过体外功能实验（细胞增殖、肿瘤球形成、Transwell迁移等）和体内动物模型研究基因功能；采用稳定同位素标记示踪技术分析代谢物转换；并利用生物信息学方法进行数据整合分析（包括公共数据集GBmap、Ivy Glioblastoma Atlas和Ravi的空间转录组数据）。

SCAR准确区分嵌合肿瘤模型中的恶性与非恶性细胞

研究人员通过10X Visium对GSC异种移植模型和TNP hNSC异种移植胶质瘤模型进行空间转录组测序，利用SCAR工具将单个转录本分配给恶性(人源)和非恶性(鼠源)细胞，揭示了肿瘤细胞在不同脑区的空间分布。SCAR在区分物种特异性转录本方面表现出优于标准方法的性能，在不同比例的小鼠与人类细胞模拟中均显示较低的均方根误差(RMSE)。通过基于聚类的方法和小鼠基因表达，将每个点分配到皮质(CTX)、白质(WM)、脑室下区(SVZ)等脑区，并利用内部单核RNA测序参考进行去卷积分析，确定了不同解剖区域中鼠源细胞的组成。对肿瘤基因表达进行无监督聚类和降维分析，识别出GSC模型中的五个不同簇，根据空间分布和肿瘤含量分为细胞肿瘤(CT)、细胞肿瘤与前沿混合(CT/LE)以及前沿-浸润区(LE/IZ)。差异表达分析显示，前沿的肿瘤细胞上调与浸润性生长和炎症反应相关的已知通路，如RNA剪接、粘着斑和NF-κB信号通路。SCAR还能够精确预测跨空间域的肿瘤-TME相互作用，计算肿瘤细胞(人源)与TME细胞(鼠源)之间的潜在相互作用信号，发现两个肿瘤模型在前缘区域的相互作用频率显著更高。

前沿-浸润区CKB的区域特异性上调

为阐明GBM细胞的浸润性生长机制，研究人员整合GSC和TNP模型，鉴定在LE/IZ特异性上调的保守基因。发现肌酸激酶脑型(creatine kinase brain type, CKB)在GSC和TNP的LE/IZ均显著上调，该酶参与ATP能量代谢。在Ivy数据集分析中，CKB在leading edge(LE)区域表达显著升高。免疫荧光分析证实，在两个GSC模型(GSC1和GSC2)和TNP模型的LE/IT区域CKB表达增强。分析Ravi等人发布的GBM空间转录组数据集发现，在8个有LE/IT注释的样本中，6个样本的LE/IT区域CKB表达升高。在GBM手术标本中，CKB在LE/IT区域也表现出升高表达。这些数据表明CKB可能在LE/IT促进肿瘤浸润性生长中发挥特定作用。

CKB是GBM细胞浸润性生长所必需的

为确定CKB在GBM细胞中的功能，研究人员使用两个非重叠短发夹RNA(shRNAs)敲低GSC1和GSC2中的CKB，并通过qPCR和Western blot确认敲低效率。CKB敲低显著抑制了细胞生长和肿瘤球形成。在免疫功能低下小鼠中移植对照和CKB敲低GSCs引发肿瘤，发现CKB敲低减小了肿瘤大小并延长了生存期。在两个GSC模型中，LE/IT处的浸润性肿瘤细胞显著减少，表明CKB可能驱动GBM细胞的浸润性生长。此外，CKB敲低减少了照射后的胼胝体侵袭，显著削弱了照射诱导的肿瘤迁移，导致肿瘤生长减弱，进一步支持了CKB在体内驱动肿瘤细胞浸润的作用。

星形胶质细胞在前沿-浸润区向GBM细胞提供肌酸和ATP促进浸润性生长

CKB催化肌酸与磷酸肌酸(phosphocreatine, PCr)的可逆转化，该反应用于ATP缓冲和穿梭。CKB敲低导致GSCs细胞内ATP和PCr减少，表明Cr/PCr合成或摄入存在额外缺陷。Cr生物合成涉及GATM和GAMT两种酶，其中GATM是催化合成过程中限速步骤的关键酶。GBM细胞在各解剖区域表达低水平GATM，表明其合成Cr的能力有限。研究人员发现肿瘤细胞在前沿-浸润区未显示Cr合成上调，但在细胞膜上强表达Cr转运蛋白SLC6A8，而CKB缺失引起的ATP水平降低可通过PCr补充恢复。研究发现Gatm在肿瘤核心周围区域高表达，重新分析公共GBM scRNA-seq和单核RNA-seq数据集(GBmap)发现，肿瘤相关星形胶质细胞和少突胶质细胞祖细胞(OPCs)中GATM高表达，而神经元中GAMT表达升高。细胞去卷积和星形胶质细胞标志物(如Gfap)检查显示，LE/IT处星形胶质细胞存在增加。体外实验证实，培养的星形胶质细胞条件培养基中含有高水平Cr，而神经元条件培养基中Cr水平极低。通过稳定同位素标记实验发现，星形胶质细胞消耗细胞外精氨酸，将其转化为Cr并分泌到细胞外空间。研究人员还发现星形胶质细胞在机械刺激后ATP释放显著增加，与刺激的星形胶质细胞共培养后，对照GSCs而非CKB敲低GSCs表现出ATP水平、球体大小和迁移显著增加，表明GSCs可能依赖CKB利用星形胶质细胞来源的细胞外ATP和Cr来促进其生长和运动。GATM敲低星形胶质细胞未能增加共培养GSCs的ATP水平。为评估靶向PCr穿梭在GBM中的治疗效果，用环肌酸(cyclocreatine, cCr)处理携带GSC的小鼠，发现cCr处理显著减小了肿瘤大小并限制了浸润性生长，支持cCr治疗抑制肿瘤的效果。

研究结论与讨论

准确解析GBM前沿的肿瘤细胞与环境细胞相互作用具有挑战性，原因在于LE/IT细胞数量少且当前技术分辨率有限。本研究利用嵌合模型结合空间转录组谱和先进计算工作流程，表征并靶向GBM与TME细胞在前沿的相互作用，以抑制GBM细胞的浸润性生长。SCAR计算工具在区分人/鼠特异性转录本方面优于标准工作流程，可广泛用于GBM以外多种常用异种移植模型。研究展示了其在确定区域特异性肿瘤-TME相互作用和识别空间背景下肿瘤依赖性方面的效用。需要注意的是，常用异种移植肿瘤模型的局限性在于肿瘤生长发生在免疫缺陷微环境中，因此需要在人源化小鼠模型中进一步研究免疫细胞的影响。

在GBM浸润性生长过程中，肿瘤细胞必须适应环境压力，如前沿的营养/能量匮乏，并利用替代营养源或代谢途径。在GSC和TNP模型及公共数据集中，LE/IT的GBM细胞表现出CKB的区域特异性上调，表明在该空间领域保守依赖CKB调控的Cr途径。近期两项研究强调了Cr的GBM促进作用：Rashidi等人显示在坏死区域，肿瘤相关髓系细胞上调Cr生物合成，而GBM细胞上调转运蛋白SLC6A8以在缺氧应激下促进Cr输入；另一研究表明，与更分化的胶质瘤细胞相比，GSCs上调CKB以过量产生PCr进行表观遗传重编程。本研究通过体外和体内实验证明，前沿星形胶质细胞是Cr和ATP的主要来源，可被胶质瘤分泌的细胞外CKB转化为PCr，并被胶质瘤细胞消耗以促进其浸润性生长。这一作用机制不同于先前报道，为了解Cr和微环境星形胶质细胞在特定空间背景下对胶质瘤生长的作用提供了宝贵见解，对针对浸润性GBM的靶向治疗具有重要意义。