新型实验室非依赖型土壤胞外酶活性测量设备（SEAR）的开发与应用验证

本刊推荐：本文介绍了一种创新的土壤酶活性读取器（SEAR），可在无需实验室条件下实现土壤胞外酶活性（EEA）的标准化现场测量。该技术基于荧光底物与均质化土壤反应层的酶促反应，通过透明凝胶层实时检测荧光产物，适用于多种土壤类型（pH <4至含碳酸盐土壤，SOC高达18%）及环境条件（温度6–50°C，湿度2–173% WHC）。SEAR解决了传统方法中样本储存与预处理引起的误差问题，为土壤健康评估和生物地球化学循环研究提供了可靠工具。

　　

引言

土壤胞外酶（又称非生物酶）是土壤有机质分解和矿化的关键催化因子，在碳和养分生物地球化学循环中发挥核心作用。这些酶主要来源于微生物，也可由植物根系和土壤动物产生。其活性可反映从刚释放的酶到长期稳定存在于土壤基质中的酶（如通过吸附到黏土表面或与有机质结合）的综合活性。本文将其统称为胞外酶活性（EEA）。

EEA因其直接关联养分供应等生态功能，被视作评估土壤健康的重要指标。其优势在于：一是过程特异性而非化合物特异性，可整合多种贡献同一土壤功能的个体过程（如酸性/碱性磷酸单酯酶催化有机磷矿化）；二是相较于土壤呼吸等生物活性指标，EEA对环境短期波动的敏感性较低，因稳定化酶库可保持活性达数月。

传统EEA测量方法分为两类：基于浆液的实验室方法（针对单个样本）和基于膜的土壤酶谱法（用于二维微尺度异质性检测）。两者均使用过量人工底物，测量的是潜在而非实际反应速率。浆液法可进一步分为经典实验台方法和微孔板分析法，后者因高通量和可测酶动力学而更常用。土壤酶谱法则通过底物浸渍膜检测根际或蚯蚓孔道等区域的EEA空间异质性。

尽管欧盟土壤战略2030及相关国家策略呼吁加强土壤功能评估，但生物学指标在土壤健康评估中仍占比较低。EEA应用受限的主要原因包括：传统方法需样本运输和实验室处理，长期储存和干燥预处理可能影响结果准确性；浆液制备创造的人工环境（特别是干土突然加水）可能引发 Birch型复湿效应，导致微生物细胞裂解而增强EEA。

为克服这些局限，本研究开发了土壤酶活性读取器（SEAR），结合酶谱法和微孔板分析法的操作要素，实现无实验室条件下的标准化现场测量，避免过量水相创造的人工环境。

材料与方法

方法原理与设置

SEAR的EEA测量基于土壤酶与人工荧光底物（产生7-氨基-4-甲基香豆素（AMC）或4-甲基伞形酮（MUF）的反应，通过检测产物荧光随时间增加而定量。系统包括反应板、读取器、土壤托盘和4 mm筛。反应板由被动载体构成，含反应孔（底物）和校准孔（不同浓度产物）。底物和校准物质溶于透明凝胶（99.0%水）。标准反应板包含针对碳、氮、磷循环中5组水解酶的反应孔（每底物3重复）和5浓度MUF/AMC校准孔。密封反应板建议4°C储存以防底物分解。

测量时，过筛土壤填入托盘，反应板开启面压入土壤，插入读取器。40分钟内，读取器每2分钟拍摄反应板背面荧光图像（LED激发），记录温度和时间。图像经数据分析管道处理获得EEA速率。

数据分析管道与计算

软件分析步骤包括：提取每孔像素，计算90百分位灰度值作为孔亮度；根据校准孔信号下降拟合函数校正反应孔信号（补偿传输和淬灭损失）；通过线性校准曲线（达30 μmol L^-1）将亮度转换为产物浓度；基于至少10连续数据点的线性增加段计算EEA速率（无效测量自动标记）；速率乘转换因子5100得pmol min^-1（或115得pmol mm^-2 min^-1）；最终EEA取分析重复平均值。校准孔还用于验证硬件功能和控制检测范围。

验证、分析特性与环境效应

使用11种不同质地、pH和有机碳含量的土壤及纯砂进行实验（表1；图2）。样本田间湿度下过4 mm筛使用。通过酶溶液加标砂测试底物饱和性（β-葡萄糖苷酶（GLS）和磷酸酶（PHO）模型酶）。负对照采用高压灭菌土壤计算检测限（LOD=3.3σ）。正对照通过酶稀释系列测试线性响应。土壤湿度效应测试8土壤和酶加标砂在5水分水平（2–173% WHC）的短期影响。温度效应测试两种土壤（6–55°C）的EEA响应，计算Q₁₀值。统计学采用ANOVA和Tukey HSD检验（α=0.05）。

结果

底物饱和

所有测试样本（4 GLS和2 PHO）显示相似模式：EEA随底物浓度增加至200–250 μmol L^-1达平台，随后高浓度下降（图3）。据此选择250 μmol L^-1为标准底物浓度。

检测限与重复性

基于灭菌土壤计算酶特异性LOD（例LEU图4），四酶LOD介于0.6–2.1 pmol min^-1（表2）。PHO因近零值变异性高未获值。土壤测量重复性CV介于5–50%（XYL近检测限时94%）。

正对照

四模型酶（GLS、PHO、LEU、XYL）的EEA随酶浓度增加呈线性增长（R²>0.9，LEU除外）（图5）。

土壤湿度效应

EEA对湿度的响应更多取决于土壤而非酶类型（图6；附表5）。影响整体较小，多数土壤无明确趋势。400测试对中仅20对差异显著（p<0.05）。

温度效应

6–55°C范围内，除GLS在50°C达平台外，其余酶活性呈指数增长（图7）。15–50°C的Q₁₀值介于1.4–1.8。

与传统方法比较

虽单位不可直接比较（SEAR为面积基准，传统为质量基准），但合作伙伴提供的实验数据显示，SEAR与微孔板分析法结果在干旱变暖实验和牧场管理实验中显著相关（附图3）。相关性强度因酶类型和研究而异。

讨论

方法运行原理

SEAR基于均质化土壤反应层酶与凝胶溶解底物的反应，通过背面荧光检测结合酶谱法最新进展（相机检测和延时操作）。凝胶介质允许底物快速接触土壤（尤其干土通过凝胶失水实现湿润）。反应层厚度受底物和产物传输、激发光穿透及淬灭等多因素影响，数据管道通过校准孔产品消失率校正反应孔信号（假设相同消失率）来补偿净效应。底物在饱和条件下传输不影响速率测量。

方法性能

砂加标实验证实EEA与酶浓度线性关系，满足方法基本目标。但反应层厚度未知，故无法获得单位质量活性，数据不能直接与传统方法比较。初步相对比较显示SEAR可捕获类似处理效应，但相关性因酶和研究而异，归因于方法操作差异（如SEAR避免浆液超声处理和 Birch效应）。单位面积速率较膜酶谱法高出一数量级，因凝胶接触更快且层更厚。

方法适用于广泛土壤（砂至粉砂黏壤土，pH<4至含碳酸盐土，SOC达18%），湿度和温度范围覆盖多数田间条件。4 mm过筛足够均质化。湿度效应小因凝胶湿润均衡化作用。温度响应显示酶催化反应典型特征（Q₁₀≤2，GLS50°C达最适）。无需缓冲凝胶支持田间固有pH测量，但可适配需求。底物浓度250 μM确保广泛条件下饱和，孵育时间40分钟足够线性响应且避免微生物生长影响。无菌土测试确认非生物水解可忽略。重复性变异性在荧光微孔板分析法范围内。

结论

SEAR实现无实验室现场快速测量，避免储存和预处理偏差。当前需高压电源，未来或可电池操作。工业化生产反应板和自动化数据分析支持无特殊技能操作者标准化测量，适用于实验处理比较、空间异质性或动态评估。标准设置同时测量5种水解酶，特别适合酶化学计量比评估（而非跨研究直接比较）。正在建立的数据库与模型将助力个体EEA解读。