TfWRKY40基因在Trigonella foenum-graecum L.中正向调控迪奥斯吉宁（diosgenin）的生物合成过程

《Frontiers in Plant Science》：TfWRKY40 positively regulates diosgenin biosynthesis in Trigonella foenum-graecum L.

迪奥斯吉宁合成关键转录因子TfWRKY40的调控机制研究。通过RNAi和过表达策略结合转录组分析和代谢物定量，发现TfWRKY40沉默使迪奥斯吉宁含量下降67.6%，过表达则提升59.25%，并证实其通过激活HMGR1、CAS1和CYP90B50等关键基因调控迪奥斯吉宁生物合成。本研究为植物次生代谢工程提供新靶点。

　　在植物生物学领域，研究者们长期以来关注植物体内次生代谢产物的合成机制，因为这些化合物在药物开发、农业改良以及生态适应等方面具有重要意义。Diosgenin作为一种重要的植物次生代谢产物，因其在多种生理和病理条件下的药理活性而备受瞩目。它广泛存在于单子叶和双子叶植物中，如 Dioscorea zingiberensis 和 Trigonella foenum-graecum，这些植物在自然条件下能够积累较高水平的 diosgenin。由于其在抗癌、抗炎、神经保护、心血管保护和降脂等方面的潜力，diosgenin 在现代医药领域展现出广阔的应用前景。然而，尽管已有大量关于 diosgenin 合成的分子机制研究，其在 Trigonella foenum-graecum 中的生物合成与调控机制仍不完全清楚。

Trigonella foenum-graecum 作为一种模式植物，因其生长周期短、易于栽培而成为 diosgenin 研究的理想对象。已有研究表明，外源性诱导剂，如甲基茉莉酮（MeJA）、胆固醇和角鲨烯，可以显著提高 diosgenin 的积累水平。这些研究不仅揭示了关键的生物合成酶，如 CYP72A 家族成员，还在不同诱导剂处理下确认了 diosgenin 的积累动态。此外，通过对不同种质资源的筛选，已经鉴定出一些高产 diosgenin 的植物品种，这为未来通过代谢工程手段提高其产量奠定了基础。

diosgenin 的生物合成路径起始于胆固醇，而胆固醇的合成则依赖于一系列关键酶的催化作用，包括从 C5 异戊烯醇前体（如 IPP 和 DMAPP）到 2,3-氧角鲨烯的转化。在高等植物中，IPP 和 DMAPP 主要通过细胞质中的甲羟戊酸（MVA）途径合成，其中 HMGR 是该途径中的限速酶。随后，2,3-氧角鲨烯被 cyclase 酶催化，形成环阿屯醇（cycloartenol），这是胆固醇合成的前体。在 Trigonella foenum-graecum 的叶片中，环阿屯醇合成酶（CAS）的表达被证实是唯一与 diosgenin 合成相关的，而 lanosterol 合成酶（LAS）的活性缺失，进一步验证了环阿屯醇作为关键中间体的重要性。随后，通过稳定同位素追踪技术，研究者们确认了胆固醇是 diosgenin 的直接前体，并明确了从环阿屯醇到胆固醇的九步酶促转化过程，其中包括 CAS、SSR2、SMO、CPI、CYP51、C14-R、8,7-SI、C5-SD2 和 7-DR2 等关键酶。

在胆固醇转化为 diosgenin 的过程中，涉及到一系列特定位置的氧化反应，例如 C-22、C-16 和 C-26 位点的修饰。这些反应主要由细胞色素 P450 酶（CYPs）和 UDP-葡萄糖转移酶（UGTs）催化完成。已有研究表明，在 Trigonella foenum-graecum 中，CYP90B50 和 CYP82J17 是参与这些氧化反应的重要酶。然而，由于 steroidal sapogenins 的结构复杂性，完整的生物合成和调控路径仍需进一步研究。

WRKY 转录因子作为植物中十大转录因子家族之一，被广泛认为是调控次生代谢产物合成的关键因子。在多个植物物种中，如 Withania somnifera、Artemisia annua 和 Dioscorea composita，WRKY 转录因子已被证明在调控皂苷和萜类化合物的合成中起着重要作用。例如，在 Withania somnifera 中，WsWRKY1 调控皂苷的合成，通过调节 SQS 和 SQE 基因的表达。在 Artemisia annua 中，AaWRKY1 通过直接调控 CYP71AV1 基因的转录促进青蒿素的合成。在 Dioscorea composita 中，DcWRKY11 作为皂苷合成的正向调控因子。类似地，在 Panax ginseng 中，PgWRKY4X 通过结合 SQE 基因启动子中的 W-box 元素促进人参皂苷的合成。这些研究揭示了 WRKY 转录因子在调控复杂的次生代谢通路中的核心作用。

在本研究中，我们通过比较转录组分析，从 MeJA 处理的 Trigonella foenum-graecum 幼苗中鉴定了一个 WRKY 转录因子，命名为 TfWRKY40。通过构建系统发育树和进行 Agrobacterium rhizogenes 介导的毛状根转化实验，我们进一步验证了 TfWRKY40 在 diosgenin 合成中的正向调控作用。通过 qRT-PCR 和 RNA-seq 分析，我们发现 TfWRKY40 的表达与 diosgenin 的积累水平高度相关，其过表达导致 diosgenin 含量增加 59.25%，而其沉默则导致含量减少 67.60%。这些结果表明，TfWRKY40 在 diosgenin 合成过程中可能通过激活关键的生物合成基因，如 HMGR1、CAS1 和 CYP90B50，从而发挥调控作用。

为了进一步阐明 TfWRKY40 的调控机制，我们进行了全面的转录组分析，发现 TfWRKY40 的过表达和沉默均显著影响多个与 diosgenin 合成相关的基因或转录变体。这些基因包括 HMGR1、CAS1 和 CYP90B50，它们分别属于 MVA 通路和胆固醇合成及转化路径中的关键节点。此外，还发现一些其他基因，如 PMK1、MVD、FPS、SQE2、SMO3-1、SMO3-2、8,7-SI、SMO4-3、CYP90B50 和 CYP82J17，其表达水平在 TfWRKY40 的调控下发生了显著变化。这些结果不仅揭示了 TfWRKY40 在调控 diosgenin 合成中的核心作用，还为理解胆固醇衍生的次生代谢调控机制提供了新的视角。

TfWRKY40 的核定位分析进一步支持其作为转录因子的功能。通过构建 TfWRKY40-GFP 融合蛋白并将其瞬时表达在 Nicotiana benthamiana 叶片中，我们使用共聚焦显微镜观察到 TfWRKY40 的荧光信号与核标记 H2B-ECFP 重叠，表明其主要定位在细胞核中。这一发现为 TfWRKY40 在调控基因表达中的作用提供了直接证据。

此外，我们还发现 TfWRKY40 的表达模式与 diosgenin 在不同组织中的分布密切相关。diosgenin 主要积累在叶片中，而在茎和根中含量较低，这一现象与 TfWRKY40 在叶片和茎中的表达水平一致。相比之下，其他候选基因 DN12554 和 DN20355 的表达与 diosgenin 的积累无明显相关性，进一步支持 TfWRKY40 作为 diosgenin 合成的主要调控因子。然而，由于 diosgenin 在不同组织中的合成和运输机制尚未完全明确，未来的研究仍需通过同位素标记或组织特异性代谢通路分析来揭示其合成的时空分布。

本研究的发现不仅为 diosgenin 的生物合成和调控机制提供了新的见解，还为代谢工程策略的开发奠定了基础。通过调控 TfWRKY40 的表达，有望显著提高 Trigonella foenum-graecum 中 diosgenin 的产量，从而推动其在制药领域的应用。此外，这些研究也为其他植物中 WRKY 转录因子在调控次生代谢产物合成中的作用提供了参考，有助于进一步揭示植物中复杂的代谢调控网络。未来的研究可以结合基因编辑技术、蛋白互作分析以及系统生物学方法，深入探讨 TfWRKY40 在 diosgenin 合成中的具体调控机制，以及其与其他调控因子之间的相互作用，从而为提高植物次生代谢产物的产量和质量提供更全面的理论支持和技术手段。