兔臼齿HERS细胞在牙骨质发育中的形态学作用及上皮间质转化机制探究

本刊推荐：本研究通过Micro-CT、SEM及组织学方法，系统观察兔高冠齿（hypselodont）臼齿牙骨质发育过程，揭示其三种类型（AEFC、CIFC、CMSC）的分布特征及随年龄增长的矿化规律（BV/TV与密度显著增加，P<0.05）。研究明确牙骨质功能依赖于牙周韧带（PDL）纤维插入，而上皮间质转化（EMT）作用有限，为牙骨质再生工程提供了关键形态学依据。

　　

2 Materials and methods

2.1 Experimental animals and grouping

研究选用25只新西兰白兔，按年龄分为5组（14天、21天、28天、50天及8个月），所有动物均来自大连大学附属中山医院实验动物中心，采用随机数字表法分组，饲养环境符合GB 14925-2010标准。

2.2 Specimen preparation

通过耳缘静脉注射过量戊巴比妥钠（100–150 mg/kg）处死动物，取含下颌第一臼齿的骨块，4%多聚甲醛固定。

2.3 Micro-CT analysis

使用Scanco μCT35扫描仪，参数为电压80 kV、电流500 μA、像素尺寸9.41 μm，进行三维重建与定量分析。

2.4 Scanning electron microscopy (SEM) observation

选取50天及8月组样本，经MMA树脂包埋、抛光后喷金，通过扫描电镜观察牙骨质超微结构。

2.5 Histological analysis

样本经EDTA脱钙、石蜡包埋后切片，进行H&E、Masson染色及免疫组化（PCNA、TUNEL、K14、TNALP、Vimentin），使用Bioquant Osteo软件分析。

2.6 Statistical analysis

数据以mean ± SD表示，采用单因素方差分析及Tukey’s HSD检验，P<0.05为显著差异。

3 Results

3.1 Molar morphology

兔臼齿为高冠齿，缺乏真性根尖，釉质向内折叠形成嵴状结构，牙骨质延伸至釉质折叠区连接分离的牙尖。

3.2 Distribution characteristics of cementum

SEM显示50天兔下颌第一臼齿牙骨质分布不对称：细胞性牙骨质主要位于唇侧和近中面，无细胞牙骨质集中于舌侧和远中面。

3.3 Micro-CT observations

Micro-CT定量分析显示，随年龄增长，牙骨质骨体积分数（BV/TV）和密度显著增加（8月组vs. P14组P<0.001），28天时根表面出现少量细胞性牙骨质。

3.4 Scanning electron microscopy analysis

根据Yamamoto分类系统，兔臼齿牙骨质分为三类：远中釉质表面的无细胞外源性纤维牙骨质（AEFC）、牙尖间嵌合的细胞内源性纤维牙骨质（CIFC），以及近中颊侧釉质褶皱处与牙周韧带连接的细胞混合分层牙骨质（CMSC）。CMSC表层呈板层无细胞结构，且随年龄显著增厚（P<0.001）。

3.5 Histological observations

H&E与Masson染色显示，AEFC被牙周韧带纤维穿透，CIFC内无纤维分布，CMSC则可见均匀分布的Sharpey纤维。8月时釉质细胞消失，CMSC矿化增强。

3.6 Cell proliferation and apoptosis

TUNEL检测显示凋亡信号集中于上皮细胞内层，PCNA阳性细胞位于上皮细胞与矿化牙骨质交界处，表明增殖活跃区在此界面。

3.7 Expression of molecular markers

Vimentin在AEFC及CMSC中无表达，但在CIFC区未分化上皮层阳性；K14在上皮细胞阳性表达，TNALP在牙周韧带和成牙骨质细胞表达。K14与TNALP双染未发现共表达细胞，无EMT证据。

4 Discussion

4.1 Morphogenesis of cementum

兔高冠齿牙骨质具有锚定牙周韧带、维持牙槽内固位的功能。三类牙骨质中，仅CMSC具备功能性纤维插入，其生长与牙周韧带张力相关，而CIFC主要通过矿化实现结构稳定。

4.2 Cellular origins of cementum development

实验表明，上皮细胞凋亡后，AEFC依靠牙周韧带侧成牙骨质细胞增殖与胶原纤维牵引生长。CIFC与CMSC区的增殖发生在上皮与矿化界面，上皮细胞并非牙骨质直接来源，其凋亡信号可能刺激间充质干细胞向成牙骨质细胞分化。

4.3 Does EMT occur during cementum development?

细胞标志物表达分析未发现vimentin与K14或TNALP共表达，缺乏EMT发生的证据。与PDL接触的牙骨质发育独立于上皮细胞，即使发生EMT，缺乏纤维插入的CIFC也无法行使牙周复合体功能。