葡萄酒相关酒类酒球菌（Oenococcus oeni）种内多样性模式的重新评估：基因组可塑性、群体异质性与苹果酸-乳酸发酵适应性

本文系统评估了葡萄酒中主要乳酸菌Oenococcus oeni的种内多样性模式，通过多基因座串联重复序列（MLVA）分型和全基因组测序（WGS）揭示其在极端酿酒环境（高乙醇、低pH、高总多酚指数TPI）下的适应机制。研究强调了移动遗传元件（MGEs）、前噬菌体分布和附属基因组在菌株分化中的关键作用，为开发针对现代葡萄酒挑战的苹果酸-乳酸发酵（MLF）起始剂提供了新视角。

　　

1 引言

酒类酒球菌（Oenococcus oeni）是葡萄酒中主要的乳酸菌，负责将苹果酸转化为乳酸和CO₂的苹果酸-乳酸发酵（MLF）过程，对葡萄酒品质的稳定和提升至关重要。现代葡萄酒因葡萄品种、土壤成分、气候参数和酿酒技术的多样化，其化学成分呈现高度异质性，给自发MLF带来挑战。商业发酵起始剂虽被广泛应用，但在现代葡萄酒中的效果有限，因此需从更多样的葡萄品种和化学约束中筛选更具鲁棒性的菌株。

2 材料与方法

研究收集了2021年份欧洲21款葡萄酒（11款红葡萄酒、6款白葡萄酒、4款桃红葡萄酒），涵盖包括抗真菌品种（PIWI）和马尔贝克（Malbec）在内的多个葡萄品种。通过傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析了乙醇含量、pH和总多酚指数（TPI）等参数，并使用红葡萄汁（RGJ）培养基进行菌落计数和分离。通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）进行物种鉴定，MLVA分型评估遗传多样性，全基因组测序（WGS）和生物信息学分析（包括PPanGGOLiN、ISFinder、geNomad）用于解析移动遗传元件（MGEs）和附属基因组特征。

3 结果与讨论

3.1 葡萄酒理化参数聚类分析

主成分分析（PCA）根据乙醇、pH和TPI将葡萄酒分为四组：G_A（高酸度，pH < 3.6）、G_B（中等TPI，pH > 3.75）、G_C（中等酸度和乙醇）和G_D（高乙醇和pH）。极端样本包括W5（pH 3.1）、W24（TPI 82）和W10（乙醇16.6%）。部分葡萄酒（如W18、W19）出现MLF停滞或迟缓，可能与营养限制或抑制剂有关。

3.2 O. oeni为MLF主导菌种

从385个分离株中均鉴定出O. oeni，表明其在所有葡萄酒中均为优势菌种。MLVA分型揭示94种独特VNTR谱，其中79%为新谱型，且部分与商业菌株共享，提示历史起始剂使用的潜在影响。

3.3 种内多样性及前噬菌体分布

香农指数显示红葡萄酒（尤其是高TPI样本）的菌株多样性高于白葡萄酒。前噬菌体整合酶基因（intA-intD）的检测表明，溶原性率与多样性呈负相关，且溶原菌株多携带质粒，暗示MGEs间的交叉调控。

3.4 全基因组测序与系统发育分析

48株测序菌株均属于系统发育群A，其中W10（高乙醇）菌株形成独特的AX亚谱系。AX菌株具有特定的基因组岛屿和截短基因（如apbE），可能与高乙醇适应性相关。

3.5 移动遗传元件特征

研究鉴定出149个插入序列（IS），以IS30家族为主。发现一种新型IS5样复合转座子，携带糖基化系统（包括糖基转移酶GT-A、GT-C和翻转酶GtrA）和双组分系统（TCS），可能参与细胞壁修饰和应激响应。质粒pOENI-1及其变体广泛存在，而pOENI-2携带木糖代谢基因和植物激素输出蛋白基因。前噬菌体以IntA型为主，且多溶原菌株携带质粒，提示遗传元件协同稳定。

3.6 附属基因组与选择特征

附属基因组分析显示三种模式（AG1-AG3）：AG1（AX谱系）与高乙醇适应相关，携带特有的胞外多糖（EPS）合成基因；AG2富含移动元件（如TCS转座子），与低pH适应相关；AG3多见于高TPI红葡萄酒。混合AG谱系（如AG2+AG3）存在于部分红葡萄酒中，可能通过功能互补增强群体适应性。

4 结论

研究表明，O. oeni在葡萄酒发酵过程中通过移动遗传元件（如转座子、前噬菌体、质粒）和附属基因组的动态变化，维持种内多样性以适应异质性环境。遗传谱系的分布与葡萄酒类型和化学参数（如乙醇、pH、TPI）相关，但多样性机制仍需深入探索。糖基化系统和TCS转座子等元件的功能解析，将为开发高效MLF起始剂提供新策略。