白菜BrGSL-OHa启动子自然变异通过调控MYB结合位点缺失影响芥子油苷代谢谱

本研究发现白菜（Brassica rapa L.）中BrGSL-OHa基因启动子的自然变异（缺失MYB结合位点）阻碍了与转录因子BrMYB29b的互作，从而抑制了从芥子油苷（GSL）前体 gluconapin（GNA）向 progoitrin（PRO）的转化。该研究通过QTL定位、基因功能验证（异源表达、转基因）和分子互作实验（酵母单杂、双荧光素酶报告系统），揭示了GSL代谢调控新机制，为油菜品质改良提供了重要靶点。

　　

引言

芥子油苷（Glucosinolates, GSLs）是一类主要存在于十字花科植物中的硫代次级代谢产物，其在植物防御、人类健康和风味形成中扮演着关键角色。尽管在拟南芥中GSL的生物合成途径已有较为深入的研究，但由于基因组三倍化事件，芸薹属作物（如白菜，Brassica rapa L.）的GSL代谢遗传架构更为复杂，其自然变异背后的分子机制仍知之甚少。本研究旨在利用传统的数量性状位点（Quantitative Trait Locus, QTL）分析方法，在白菜中鉴定调控GSL生物合成的关键基因并阐明其分子机制。

材料与方法

研究利用了一个由190个个体组成的双亲杂交群体（CRF_2/3），其亲本为“Chiifu 401-42”（秋白菜，参考基因组材料）和快速循环白菜（Rapid-Cycling B. rapa, RCBr）。在两个独立的环境（2012年温室春季试验和2013年大田秋季试验）中测定了叶片中13种GSL化合物的含量。利用更新的遗传图谱和WinQTL Cartographer软件进行了QTL分析，并采用多环境分析方法（Multi-Environment Approach, MEA）评估了QTL与环境的互作（Q×E）效应。此外，还利用了一个包含85份不同白菜自交系的自然群体进行基因型与表型的关联分析。

候选基因BrGSL-OHa的功能通过多种技术手段进行验证：通过定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）分析其表达模式；通过在大肠杆菌（Escherichia coli）中异源表达并纯化BrGSL-OHa蛋白，进行体外酶活 assay，使用液相色谱-电喷雾电离质谱（LC-ESI-MS）检测其催化底物GNA生成PRO的能力；通过构建过表达（Overexpression, OE）载体并转化白菜和甘蓝型油菜“Westar”获得转基因植株，在体内验证其功能。

为了阐明BrGSL-OHa的表达调控机制，克隆了其来自不同材料的启动子序列，并利用PlantCARE在线工具预测顺式作用元件。通过酵母单杂交（Yeast One-Hybrid, Y1H）和双荧光素酶报告系统（Dual-Luciferase Reporter Assay）检测了候选MYB转录因子（包括BrMYB28a, BrMYB28b, BrMYB28c, BrMYB29a, BrMYB29b）与不同版本启动子的结合能力。通过农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导的遗传转化获得了BrMYB29b的过表达转基因白菜植株，并分析了其下游基因表达及GSL谱的变化。利用绿色荧光蛋白（GFP）融合蛋白在拟南芥原生质体中对BrMYB29b进行了亚细胞定位。

结果

3.1 CRF_2/3群体叶片GSL含量的定量变异

在两个亲本及CRF_2/3群体中共检测到13种GSLs。亲本间表现出截然不同的GSL谱：油用亲本RCBr中以aliphatic 4C组的gluconapin（GNA）为主导，其最高浓度在2013AF试验中达到20.76 μmol g^?1 DW；而菜用亲本Chiifu中则以GNA的羟基化产物progoitrin（PRO）为主导，其在2012SG试验中的最高浓度为2.37 μmol g^?1 DW。群体中大多数GSL表型呈现连续分布和广泛变异，存在超亲分离现象，表明GSL生物合成受多基因控制。

3.2 叶片GSL含量的QTL鉴定

QTL分析共鉴定出60个与脂肪族GSL（Ali-GSL）相关的QTL（Ali-QTLs），主要分布在A02和A03染色体上。其中，在A03染色体上发现了两个重要的QTL簇：QTL-Cluster3（中下部）和QTL-Cluster2。QTL-Cluster3是一个“热点”区域，与GNA、glucoraphanin（GRA）、PRO、glucoalyssin（ALY）、glucobrassicanapin（GBN）、gluconapoleiferin（GNL）等多种Ali-GSLs以及总Ali-GSL含量相关，可解释4-21.5%的表型变异。该区域锚定了多个GSL生物合成与调控的同源基因，如BrBCAT4a, BrAPK1, BrMAM3b, BrMAM3c, BrMAM1c, BrMYB34c, BrMYB28b。QTL-Cluster2则与PRO、GNA、GER、ALY和GNL的QTL共定位，可解释5-20%的表型变异，其中锚定了与拟南芥PRO形成基因同源的BrGSL-OHa（Bra022920）。RCBr的等位基因增加了GNA含量但降低了PRO含量。多环境分析（MEA）鉴定出6个QTL存在显著的Q×E效应，而位于QTL-Cluster2和QTL-Cluster3的一些QTL则表现稳定，无Q×E效应。

3.3 BrGSL-OHa的表达变异贡献于GNA和PRO的QTL

与菜用白菜相比，油用RCBr品系表现出高GNA和极低PRO的极端表型。序列分析发现，不同白菜材料的BrGSL-OHa编码区序列高度保守，无显著差异。然而，表达分析显示，BrGSL-OHa在亲本Chiifu中转录水平较高，而在RCBr中几乎检测不到转录本。在85份自然群体中，仅在另一个油用品系‘KYS’中也检测不到BrGSL-OHa转录本，该品系同样表现出高GNA和低PRO的表型。这表明RCBr和KYS中的BrGSL-OHa是一个罕见的非功能性等位基因。

功能验证实验证实了BrGSL-OHa的功能：异源表达的BrGSL-OHa蛋白在体外能有效催化GNA底物生成PRO；在白菜背景中过表达BrGSL-OHa（C-24）的转基因株系，其BrGSL-OHa转录水平和PRO含量均显著高于野生型。

3.4 BrGSL-OHa的启动子变异影响其表达和PRO合成

对85份不同白菜材料的BrGSL-OHa启动子进行克隆和序列分析发现，其启动子序列在白菜（包括秋白菜、小白菜、菜心和大多数油用白菜）中高度保守，形成Pro-type1型（与Chiifu一致）。仅在RCBr和KYS两个油用品系中发现了显著差异（Pro-type2型）。顺式元件预测发现，在Pro-type1型启动子的-460 bp处存在一个MYB结合位点（MBS），而RCBr和KYS的Pro-type2型启动子恰好缺失了这一MBS。

为了证明启动子变异直接影响基因表达，研究构建了两种转基因载体：Construct I（BrGSL-OHa^chiifupro:BrGSL-OHa^chiifu）和Construct II（BrGSL-OHa^RCBrpro:BrGSL-OHa^RCBr），并转化至甘蓝型油菜“Westar”。结果表明，携带Chiifu启动子（含MBS）的转基因株系（Construct I）其BrGSL-OHa转录水平和PRO含量显著高于野生型；而携带RCBr启动子（缺MBS）的转基因株系（Construct II）则未能积累更多的PRO。这证明启动子的自然多态性（MBS缺失）是导致基因表达差异的原因。

3.5 BrGSL-OHa的表达直接受转录因子BrMYB29b的调控

在拟南芥中，MYB28、MYB29和MYB76等R2R3-MYB转录因子正向调控Ali-GSL途径。本研究通过酵母单杂交（Y1H）和双荧光素酶报告系统（LUC） assay，从5个候选MYB基因（BrMYB28a, BrMYB28b, BrMYB28c, BrMYB29a, BrMYB29b）中鉴定出BrMYB29b（Bra009245）能与BrGSL-OHa^Chiifu启动子（含MBS）特异性结合，而与缺失MBS的BrGSL-OHa^RCBr启动子结合能力显著减弱。亚细胞定位显示BrMYB29b蛋白定位于细胞核，符合其转录因子特性。

在白菜中过表达BrMYB29b的转基因植株，其BrMYB29b、BrGSL-OHa的转录水平以及PRO含量均极显著高于野生型。此外，GRA、GNA、GBN的含量也有1.5-2倍的增加，同时多个GSL生物合成关键基因（如MAM1、AOP2、MYB28的多个旁系同源基因）的表达也被上调，而另一个MYB29旁系同源基因MYB29a的表达未受影响。这表明BrMYB29b是白菜中正向调控Ali-GSL（尤其是PRO）生物合成的一个重要转录因子。

讨论

本研究揭示了一个调控白菜芥子油苷代谢自然变异的分子机制。在大多数白菜基因型（Pro-type1）中，转录因子BrMYB29b能够结合到BrGSL-OHa启动子的MBS上，激活其表达，进而催化GNA向PRO的转化。而在RCBr和KYS等少数油用品系中，由于其BrGSL-OHa启动子缺失了MBS（Pro-type2），无法与BrMYB29b有效结合，导致BrGSL-OHa表达被抑制，PRO生物合成受阻，从而造成GNA的大量积累。

这一发现具有重要的理论和实践意义。在理论上，它揭示了芸薹属作物中GSL代谢调控网络的复杂性，以及转录调控在产生代谢物自然变异中的关键作用。在实践上，PRO是一种抗营养因子，会降低油籽饼粕的饲用品质。在油用白菜育种中，这一罕见的非功能性等位基因（缺失MBS的启动子）是一个有价值的遗传资源，可通过标记辅助选择将其导入优良品种，旨在降低PRO含量、改善饼粕质量。相反，在菜用白菜中，某些GSLs贡献于风味和抗病性，因此功能性的Pro-type1等位基因可能更为可取。该研究为芸薹属作物的品质改良和代谢工程提供了重要的靶点和理论依据。