中国吉林省羊口疮病毒株（ORFV-CL24）的分离鉴定及其基因组特征解析

本研究首次在中国吉林省羊群中分离并鉴定了新型羊口疮病毒（ORFV）毒株ORFV-CL24，完成全基因组测序（GenBank: PV126639），揭示其与减毒株D1701的进化关联及关键基因（B2L、E3L）突变特征，为ORFV的分子演化、宿主适应及疫病防控提供重要遗传学依据。

　　

引言

羊口疮（Orf）又称传染性脓疱皮炎（contagious ecthyma, CE），是由羊口疮病毒（Orf virus, ORFV）引起的一种急性、高度接触性人畜共患病，主要感染绵羊、山羊等反刍动物，亦可传播至人类。该病在全球养羊业发达地区广泛分布，典型临床症状包括唇部、眼睑等皮肤部位的丘疹、脓疱及结痂病变，严重时可继发细菌感染甚至导致死亡。ORFV属于痘病毒科（Poxviridae）副痘病毒属（Parapoxvirus），其病毒粒子呈卵圆形，大小约260×160 nm，具有独特的螺旋状表面结构。基因组为线性双链DNA，长度约138 kbp，GC含量高达63–64%，两端包含反向末端重复序列（inverted terminal repeats, ITRs），核心区域编码病毒复制必需蛋白，末端区域则与病毒宿主范围及免疫调节相关。近年来，ORFV感染发病率呈上升趋势，造成严重经济损失，但由于病毒遗传变异频繁及免疫逃逸机制复杂，其诊断、治疗及防控仍面临挑战。

材料与方法

本研究于2024年在中国吉林省长岭县某羊场发生自然ORFV感染疫情后，采集患病羊唇部及眼睑部痂皮及水疱组织样本。组织样本经甲醛固定后行苏木精-伊红（H&E）染色进行病理学观察；同时将组织匀浆液接种于绵羊胎儿鼻甲细胞（OFTu）进行病毒分离，通过细胞病变效应（cytopathic effect, CPE）、透射电镜（transmission electron microscopy, TEM）、Western blot及间接免疫荧光（indirect immunofluorescence assay, IFA）鉴定病毒。病毒DNA提取后采用特异性引物扩增ORFV 011（B2L）、ORFV 020（E3L）及ORFV 059基因，并通过Illumina NovaSeq 6000平台完成全基因组测序及组装。基因组注释、ITR特征分析及系统进化树构建分别采用Proksee、Clustal Omega、MAFFT及IQ-TREE 2等工具完成。

结果

大体病理变化

患病羊唇部及眼睑部出现多发性结节性病变，伴溃疡、结痂及出血灶（图1），病变局限于皮肤及皮肤黏膜交界处，内脏器官未见明显病变。

组织病理学检查

H&E染色显示感染羊组织表皮显著增生、角化过度、棘层增厚，棘细胞空泡化及核碎裂，并伴有中性粒细胞浸润及微脓肿形成（图2），对照组未见异常。

病毒分离与鉴定

接种OFTu细胞5代后出现典型CPE（细胞圆缩、脱落）；PCR扩增出ORFV 011（269 bp）、ORFV 020（381 bp）及ORFV 059（256 bp）特异性条带（图3D）；电镜观察可见150–300 nm卵圆形病毒粒子，表面呈螺旋状结构（图3C）；Western blot检测到50 kDa ORFV蛋白条带（图3E）。

病毒感染力测定

IFA显示病毒抗原聚集于感染细胞核周区（图4A）；TCID₅₀测定显示第2、4、6代病毒滴度分别为10^5.64、10^6.29及10^6.23/0.1 mL（图4C）；空斑试验进一步证实病毒复制稳定性（图4B）。

基因组结构

ORFV-CL24基因组全长138,500 bp，包含131个开放阅读框（ORFs），GC含量63.3%，两端为3,264 bp ITR区域（图5A）。基因功能富集分析显示基因主要参与代谢、催化及分子结合过程（图5C）。比较基因组分析显示其与16株ORFV代表株核苷酸同源性为93.6–97.0%，与D1701株相似度最高（97.0%）（图7A）。ITR区发现BamHI酶切位点（5′-GGATCC-3′）及端粒解析 motif（5′-ATTTTTT-N₈-TAAAT-3′）等保守元件（图7B）。

系统进化分析

全基因组系统进化显示ORFV-CL24与减毒株D1701聚为一支（图6A）；ORFV 011（B2L）基因分析发现V80I、V101I氨基酸替换（ Supplementary Figure 3A），ORFV 020（E3L）基因存在S14Q、R123K突变（ Supplementary Figure 3B），提示宿主适应过程中逐步累积的遗传变异（图6B–E）。

讨论

本研究成功分离并鉴定了中国吉林省ORFV流行株ORFV-CL24，解析其全基因组特征及进化地位。研究发现该毒株与减毒疫苗株D1701亲缘关系最近，但ITR区同源性低于20%，提示二者可能源于共同祖先，但通过终端区域变异分化出不同毒力表型。ORFV 011和ORFV 020基因的特异性突变可能影响病毒免疫调节功能及宿主适应性。研究结果为ORFV的分子流行病学、病毒演化及疫苗研发提供了关键数据，对控制羊口疮传播及减少人畜共患风险具有重要意义。