基于Steered Molecular Dynamics揭示GerAB残基Y97、L199和F342通过调控水通道功能影响芽孢萌发体的结构与功能

本研究通过Steered Molecular Dynamics（SMD）模拟结合定点突变实验，鉴定出GerAB蛋白中三个关键残基（Y97、L199、F342）对水通道功能的调控作用，并揭示其在维持Germinant Receptor（GR）结构稳定性及Germinosome功能协同中的核心机制，为理解芽孢萌发过程提供重要分子基础。

　　

1 引言

在不利环境条件下，部分芽孢杆菌目（Bacillales）和梭菌目（Clostridiales）细菌可形成代谢休眠的芽孢。这些芽孢虽处于休眠状态，却能在感知到称为“萌发剂（germinants）”的低分子量营养物质后迅速恢复代谢活性。研究表明，枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）芽孢萌发受体GerA的一个内膜蛋白GerAB参与L-丙氨酸（L-alanine）诱导的萌发过程。此前研究通过分子模拟提出GerAB内可能存在水通道，但其功能与机制尚未经实验验证。本研究在前期分子动力学模拟基础上，进一步采用Steered Molecular Dynamics（SMD）方法研究水分子穿越GerAB的机制，并聚焦于可能阻碍水通行的关键氨基酸残基。

2 结果

2.1 关键残基的识别

通过SMD模拟，将水分子从芽孢内膜外侧强制牵引至内侧，识别出三个可能阻碍水分子穿行的残基：Y97（位于跨膜区TM3）、L199（TM6）和F342（TM10）。这三个残基均带有庞大侧链，构成一个“三联阻遏结构（triad）”。牵引过程中所做的功（Δw）差异显著（37–293 kJ/mol），说明水分子穿越该区域时存在不同的路径和能障。序列比对显示，Y97在多种芽孢杆菌的萌发受体B亚基中高度保守，提示其可能具有跨物种的功能重要性。

2.2 Y97、L199与F342对Germinosome功能的重要性

研究成功构建了GerAB单点突变体（Y97A、L199A、F342A）及三突变体（triA）。萌发实验表明，在L-丙氨酸刺激下，仅Y97A突变体仍能萌发（效率约61%），其余突变体完全丧失响应；而在AGFK混合物（L-天冬酰胺、D-葡萄糖、D-果糖与K⁺）刺激下，所有突变体的萌发效率均下降。Western Blot结果显示，只有Y97A突变体中可检测到GerAA蛋白（ albeit 表达量降低），而L199A、F342A及triA突变体中GerA受体完全未能组装，说明后两个残基对维持GerAB结构稳定性至关重要。此外，GerA的缺失还会影响GerB与GerK对AGFK的响应，表明Germinosome中不同萌发受体之间存在功能交叉与结构互作。

3 讨论

本研究通过SMD模拟识别出GerAB中三个可能阻碍水分子穿行的关键残基，并利用突变体验证了它们在维持GerA受体稳定性及萌发功能中的必要性。尽管由于部分突变导致蛋白未能正确组装，无法直接验证这些残基在水通道中的具体作用，但Y97A仍为研究其功能提供了窗口。该研究不仅深化了对芽孢萌发过程中水吸收机制的理解，也为研究膜蛋白动态功能提供了一种结合计算模拟与实验验证的研究范式。

4 材料与方法

4.1 模拟与分析方法

基于此前发表的GerAB结构模型，进行100 ns分子动力学（MD）模拟，系统设置采用CHARMM36力场与TIP3P水模型。SMD模拟使用PLUMED 2.7.0实现，通过施加谐波势将水分子沿z轴方向牵引，记录其做功变化。轨迹分析通过VMD完成，蛋白残基间接触分析则借助Contact Map Explorer与RING完成。

4.2 突变体构建与表型分析

以B. subtilis PY79为背景，利用定点突变技术构建GerAB突变体，并通过同源重组整合至基因组。通过相衬显微镜观察萌发效率，Western Blot检测GerAA蛋白表达，并利用OD₆₀₀下降及DPA释放实验定量评估萌发动力学。所有实验均设三次重复，数据以均值±标准差表示。