脂肪间充质干细胞条件培养基通过靶向TNF和趋化因子信号通路加速2型糖尿病创面愈合

本研究揭示了脂肪源性间充质干细胞条件培养基（ACM）在2型糖尿病创面治疗中的突破性机制。通过体内外实验证实，ACM不仅能显著促进人脐静脉内皮细胞（HUVEC）增殖和血管生成（上调EGF/bFGF/VEGF/KDR表达），更通过下调TNF-α/IL-1β/IL-6等炎症因子，抑制TNF和趋化因子信号通路（CXCL1/CXCL2/CXCL8），重塑糖尿病创面微环境。该研究为糖尿病难愈性创面提供了创新的无细胞治疗策略。

　　

1 引言

皮肤创面愈合是一个涉及止血、炎症、血管生成和重塑的多阶段复杂过程，需要多种细胞类型和信号通路的协同作用。糖尿病患者的创面愈合延迟在全球范围内日益严重，这主要源于有效干预策略的缺乏和糖尿病的高流行率。脂肪源性间充质干细胞（ADSCs）因其优异的免疫调节、多向分化能力和旁分泌功能，已成为治疗糖尿病创面的新兴策略。然而，ADSCs在修复糖尿病创面时的低植入效率限制了其疗效，这部分归因于体外优化培养条件与慢性创面恶劣病理微环境之间的巨大差异。

近年来，越来越多的证据表明ADSCs的旁分泌功能在皮肤创面再生中起主导作用。特别是，使用间充质干细胞条件培养基或分泌组而非间充质干细胞本身，也显示出减少放射性皮肤损伤和瘢痕纤维化的治疗潜力。更重要的是，这种无细胞策略有效避免了间充质干细胞用于创面愈合时低细胞植入的潜在限制。本研究旨在探讨ADSC条件培养基（ACM）能否用于加速大鼠糖尿病创面愈合，通过评估ACM在体外和体内对皮肤创面的治疗效果及其在糖尿病创面愈合中的潜在机制。

2 材料与方法

2.1 动物

二十只成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠（体重180-200克）购自上海斯莱克实验动物中心（许可证号：SCXK hu 2022-0004）。所有大鼠在标准无特定病原体（SPF）屏障环境中饲养，温度20-26℃，湿度40%-70%，12小时/12小时光暗循环。所有动物实验均经福建医科大学孟超肝胆医院实验动物伦理中心批准（MCHH-AEC-2022-08）。所有实验均按照动物研究：体内实验报告（ARRIVE）指南2.0进行设计和报告。

2.2 ADSC条件培养基的制备

ADSCs的分离和培养根据先前发表的方法进行。简要来说，从雄性SD大鼠（n=5）的腹股沟区获取脂肪组织并用PBS溶液洗涤。将组织切成小碎片后用0.1% I型胶原酶消化，随后用含10% FBS的α-MEM中和。接着，以1×10⁶细胞/mL的密度在T-75培养板中培养细胞。收集第3代ADSCs并以2×10⁶细胞/10 cm培养板的密度培养。细胞过夜粘附后，用PBS溶液洗涤培养的ADSCs以去除残留血清，然后更换为无血清培养基（YOCON，中国）培养48小时。孵育后，收集条件培养基（10 mL/2×10⁶ ADSCs）并以3,000 g离心5分钟去除任何细胞碎片。此外，使用含有3-kDa分子量截留膜的切向流过滤胶囊（Pall，美国）通过超滤浓缩ADSC条件培养基，按照制造商说明进行。最后，使用BCA检测试剂盒（TransGen Biotech，中国）分析ADSC条件培养基的浓度并储存于-80℃。本研究使用100 ng/mL浓度的ADSC条件培养基。

2.3 HUVEC培养

人脐静脉内皮细胞（HUVEC）系购自中国食品药品检定研究院（北京，中国），并在含有10% FBS的RPMI 1640中培养，补充2% FBS、VEGF、IGF-1和EGF，于37℃/5% CO₂条件下。对于管形成实验，96孔板预先用Matrigel（Corning，10 mg/mL，1:50稀释于EGM-2中）在37℃包被1小时以模拟基底膜基质，如血管生成测定中的标准化方法。

2.4 细胞活力测定

将HUVECs以每孔1×10⁴个细胞的密度接种于96孔板中。细胞过夜粘附后，去除细胞上清并更换为100 μL ADSC条件培养基，而用无血清培养基处理的细胞作为阴性对照。孵育24或48小时后，使用CCK-8测定试剂盒（TransGen Biotech，中国）根据制造商说明评估细胞活力。

2.5 定量实时PCR分析

使用TRIzol试剂盒（TransGen Biotech，中国）按照制造商说明收集总RNA。随后，使用cDNA合成试剂盒（Roche，德国）将mRNA反转录为cDNA。定量实时PCR分析在ABI StepOnePlus实时PCR系统（Carlsbad，美国）中进行，PCR条件如下：95℃ 15秒，60℃ 30秒，70℃ 30秒，共40个循环。引物序列列于表1。使用2^-△△Ct公式分析相对基因表达。

2.6 糖尿病皮肤损伤模型及ACM处理

使用先前描述的方法建立2型糖尿病（T2D）模型。简要来说，SD大鼠（n=10）饲喂高脂饮食（HFD），包含66.5%正常饲料、20%蔗糖、10%猪油、2%胆固醇和1.5%胆酸盐。饲喂HFD 4周后，所有大鼠通过腹腔注射给予25 mg/kg链脲佐菌素（STZ），每周两次，持续2周。经STZ处理且非空腹血糖水平≥11.1 mmol/L的大鼠被认为成功建立T2D模型。接着，用40 mg/kg戊巴比妥钠麻醉T2D大鼠，并使用先前描述的方法创建直径为1 cm的全层皮肤缺损。随后，将大鼠随机（随机表法）分为T2D皮肤损伤模型组和ACM组（n=5/组）并分笼饲养。ACM组大鼠每天在创缘周围皮内注射100 μL ACM，持续7天，而模型组大鼠接受等体积无血清培养基。正常大鼠（n=5）作为阴性对照。最后一次ACM处理后第5天（总共第12天），所有大鼠用100 mg/kg戊巴比妥钠安乐死，并采集创面用于进一步评估。所有动物随机选择进行结果评估。

2.7 组织学检查

收集组织并在4%多聚甲醛中固定24小时，然后石蜡包埋并切片。分别用苏木精和伊红（HE）染色和Masson染色评估组织切片。最后，由两位专家病理学家使用正置显微镜（Zeiss，德国）进行双盲组织学检查。

2.8 RNA测序

对来自皮肤组织的总RNA在Illumina HiSeq X10平台上进行polyA选择的RNA测序，采用盲法。使用DESeq2软件包进行RNA-seq分析，以确定三组之间的差异基因表达（DEG）：正常组 vs. 模型组和ACM组 vs. 模型组。错误发现率（FDR）<0.05且倍数变化≥2或≤2是DEG筛选的原则。使用基因本体（GO）分析分析DEG的基因功能，并使用京都基因与基因组百科全书（KEGG）分析靶向DEG的富集通路。

2.9 免疫组织化学

将皮肤创面切片浸入柠檬酸盐抗原修复液（Beyotime Institute of Biotechnology，中国）中，并在高压锅中热处理2分钟，自然冷却至室温，并用PBS缓冲液洗涤三次。随后与3% H₂O₂孵育10分钟后，用5% BSA封闭30分钟。然后将切片在4℃下与抗TNF-α、NF-κB、p-NF-κB、MAPK、p-MAPK、CXCL1、CXCL2和CXCL8的一抗（稀释比例1:200）孵育过夜。用PBS洗涤三次后，切片在室温下与二抗再孵育2小时，随后用DAB染色。由评估者使用正置显微镜（Zeiss，德国）盲法观察样品。

2.10 统计分析

所有定量数据表示为平均值±标准差。使用GraphPad Prism 9.0版（GraphPad Software，美国）进行统计分析。使用ANOVA评估三个独立组之间的显著差异，而使用双尾配对样本Student t检验评估两组之间的显著差异。p<0.05被认为具有统计学显著差异。

3 结果

3.1 ACM在体外促进HUVEC血管生成和增殖

流式细胞术分析显示，ADSCs通常表达CD73和CD90，而缺乏CD45、CD19和CD34的表达，表明本研究成功分离和培养了ADSCs。糖尿病患者皮肤创面愈合受损主要归因于糖尿病血管病变，其特征是全身动脉功能障碍和损伤。因此，本研究探讨了ACM对血管细胞血管生成和增殖的影响。与ACM孵育24或48小时后，HUVECs的活力显著增加，表明ACM促进了HUVEC增殖。连续ACM孵育2天后，HUVECs显示出血管样形态变化，并且与血管生成相关的基因表达，包括EGF、bFGF、VEGF和KDR，在ACM处理后显著上调，暗示ACM在体外促进HUVEC血管生成。

3.2 ACM加速T2D皮肤创面愈合

基于ACM在血管细胞中的促血管生成潜力，我们建立了T2D皮肤创面模型以进一步评估其治疗效果。与模型组相比，连续ACM处理7天后，T2D大鼠的皮肤创面愈合率显著提高。此外，与模型组相比，ACM组观察到组织再生增加和炎症浸润减少。鉴于ACM在体外血管生成中的优异表现，我们还研究了ACM在体内对血管病变的有益影响。我们发现，与模型组相比，ACM组中CD31⁺细胞的数量以及FGF-2和VEGF的表达显著增加，表明ACM在体内也能改善血管病变。因此，这些数据表明ACM加速了T2D皮肤创面愈合。

3.3 ACM抑制T2D皮肤创面炎症

考虑到过度炎症是皮肤创面的典型特征，我们进一步分析了T2D皮肤创面组织中的炎症基因。与正常皮肤组织相比，T2D皮肤创面中TNF-α、IL-1β、IL-6、COX-2、IL-12和IFN-γ的mRNA表达水平显著增加，表明存在过度炎症。然而，与模型组相比，这些水平在ACM处理后有效降低，表明ACM可以抑制这种过度炎症。此外，我们发现ACM处理减少了炎症细胞浸润。这包括CD3⁺ T细胞和F4/80⁺巨噬细胞的减少。此外，ACM处理组中TNF-α、IL-1β和IL-6的表达显著降低。总之，这些数据表明ACM减轻了糖尿病大鼠皮肤创面的炎症反应。

3.4 ACM通过靶向TNF和趋化因子信号通路促进T2D皮肤创面愈合

通过RNA测序进一步探索了ACM加速T2D皮肤创面愈合的潜在分子机制。火山图分析显示，正常组与模型组之间有10,655个基因表达差异，ACM组与模型组之间有5,287个基因表达差异；两组比较共有4,269个基因常见。GO注释和通路富集分析显示，模型组中观察到TNF和趋化因子信号通路上调（与正常组相比），而与模型组相比，ACM组中 clearly 观察到TNF和趋化因子信号通路下调，表明ACM在T2D皮肤创面愈合中的潜在分子机制是通过靶向TNF和趋化因子信号通路。

为确认RNA测序结果，我们进一步评估了TNF和趋化因子信号通路中主要调节因子的蛋白表达。TNF信号相关蛋白，包括TNF-α、NF-κB、p-NF-κB、MAPK和p-MAPK，以及趋化因子信号相关蛋白，包括CXCL1、CXCL2和CXCL8，在T2D皮肤创面中均被ACM处理下调，表明ACM通过下调TNF和趋化因子信号加速T2D皮肤创面愈合。

4 讨论

血管生成是皮肤创面再生的关键部分，也容易受到糖尿病状态、过度炎症、氧化应激和其他慢性创面条件的影响。鉴于间充质干细胞通过旁分泌因子（如VEGF、EGF和bFGF）在促进血管生成中的优异表现，间充质干细胞分泌组或条件培养基为加速皮肤创面血管生成提供了新策略。本研究评估了脂肪组织来源的ACM，以确认其对血管生成的有益效果，得益于脂肪组织的丰富可用性和易获取性。正如预期，ACM有效促进了HUVEC增殖和血管生成。特别是，ACM还上调了HUVECs中VEGF、EGF、bFGF和KDR的表达。因此，这些数据表明ACM有助于皮肤创面再生。

考虑到T2D占糖尿病病例的90%以上，使用T2D皮肤创面损伤大鼠模型评估ACM对皮肤创面的治疗效果。显著的是，我们发现ACM可以提高皮肤创面愈合率。众所周知，过度炎症是由各种免疫细胞（包括中性粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞）的相互作用引起的，其特征也是各种促炎因子（包括TNF-α、IL-1β、IL-6、COX-2、IL-12和IFN-γ）的高表达。在本研究中，我们证明这些促炎因子在皮肤创面中高表达，这意味着T2D大鼠发生了过度炎症。更重要的是，我们发现ACM可以减少过度炎症。特别是，转录组测序数据进一步证实，ACM加速T2D皮肤创面愈合与TNF和趋化因子信号通路的下调密切相关。总之，ACM为加速T2D皮肤创面愈合提供了一种新的有前景的策略，这部分是通过TNF和趋化因子信号通路实现的。

先前研究表明，ADSC分泌组通过抑制TGF-β1和胶原表达减少皮肤创面愈合中的瘢痕形成。旁分泌细胞因子和细胞外囊泡（如外泌体）已被报道为ADSCs对创面愈合生物效应的主要因素。在本研究中，我们进一步证明ACM通过其抗炎功能加速糖尿病皮肤创面愈合。鉴于间充质干细胞条件培养基或分泌组具有复杂的组成，包括细胞外囊泡（含有各种类型的脂质、蛋白质和核酸）和效应分子（如PGE2和IDO），ACM在皮肤创面再生中的增强可能涉及多个靶点和通路。进一步的研究应侧重于ACM在T2D皮肤创面修复治疗作用中的不同组分和靶点，以验证更详细的机制。最近，Yin等人报道ADSC外泌体通过调节巨噬细胞极化和表皮自噬促进糖尿病创面愈合。因此，ACM的外泌体将在加速糖尿病创面愈合中发挥关键作用。此外，在进行进一步的临床试验或应用之前，确保对ACM大规模生产、稳定性和质量相关方面的严格控制至关重要。

在本研究中，我们表明ACM可以增强血管增殖和血管生成，促进2型糖尿病中的皮肤创面愈合，并抑制炎症反应。其机制可能涉及TNF和趋化因子通路的下调。

5 结论

总之，我们的研究表明，ACM可以通过促进血管重塑和通过TNF和趋化因子通路抑制炎症，显著加速糖尿病皮肤创面的愈合。