CGRP通过cAMP/PKA/CREB信号通路驱动骨髓干细胞成骨分化：牵张成骨机制与治疗潜力

本研究系统揭示了降钙素基因相关肽（CGRP）通过激活cAMP/PKA/CREB信号通路，显著增强骨髓间充质干细胞（BMSCs）的增殖、迁移、抗凋亡及成骨分化能力。在大鼠股骨牵张成骨（DO）模型中，局部应用CGRP（10?8 M）可加速骨形成，提高骨矿物质密度（BMD）和生物力学性能，为优化DO临床疗效提供了新策略。

　　

3.1 CGRP对体外BMSC功能的影响

3.1.1 BMSC培养与表征

原代培养的BMSC在接种后24-48小时开始贴壁，呈现典型的长梭形、纺锤形或不规则三角形形态，细胞核清晰，细胞质丰富，以集落样或漩涡状排列生长。流式细胞术结果显示第四代BMSC高表达间充质干细胞表面标志物CD29（平均阳性率>95%）、CD105（平均阳性率>95%）和CD90（平均阳性率>95%），而造血干细胞表面标志物CD45表达极低（平均阳性率<5%），符合BMSC表型特征。多向分化实验显示，经过21天成骨诱导后，茜素红S染色可见丰富的橙红色钙化结节形成；14天成脂诱导后，油红O染色显示细胞内大量红色脂滴；21天成软骨诱导后，阿利新蓝染色显示细胞外基质中蓝色蛋白聚糖沉积。对照组细胞未见明显分化迹象，证明成功分离培养的细胞具有典型BMSC特性。

3.1.2 CGRP对BMSC增殖的影响

CCK-8检测结果显示，不同浓度CGRP（10^?11 M至10^?7 M）以时间和剂量依赖方式不同程度促进BMSC增殖。培养第3、5、7天，10^?9 M、10^?8 M和10^?7 M CGRP处理组细胞OD值显著高于对照组，其中10^?8 M CGRP在各时间点均表现出最强促增殖作用，故后续实验选择该浓度为最佳处理条件。

3.1.3 CGRP对BMSC存活与形态的影响

Calcein AM/PI活死细胞染色显示，培养1天和3天后，所有处理组均以绿色荧光（Calcein AM阳性，活细胞）为主，红色荧光信号（PI阳性，死细胞核）极少，表明各组细胞存活状态良好。Phalloidin/DAPI染色观察细胞形态和F-actin分布发现，CGRP处理的BMSC铺展更广泛，细胞形态更伸长，伪足清晰，细胞内F-actin微丝束更粗且排列有序，形成良好的细胞内张力结构。对照组细胞铺展程度和F-actin组织相对较差，而CGRP与CGRP8-37或H89联合处理组细胞铺展和F-actin组织程度介于对照组和CGRP组之间，表明CGRP的形态学效应也依赖其受体和PKA通路激活。

3.1.4 CGRP对BMSC凋亡的影响

采用无血清培养诱导凋亡，Annexin V-FITC/PI流式细胞术结果显示，对照组细胞在无血清培养24小时后出现明显凋亡。10^?8 M CGRP处理显著降低BMSC总凋亡率（41.07%±1.78% vs. 22.18%±1.42%）。当CGRP与受体拮抗剂CGRP8-37或PKA抑制剂H89联合处理时，CGRP的抗凋亡作用被显著削弱或逆转，凋亡率接近对照组水平，证明CGRP在应激条件下有效抑制BMSC凋亡，且该保护作用依赖CGRP受体激活和下游PKA信号通路完整。

3.1.5 CGRP对BMSC迁移能力的影响

划痕实验和Transwell迁移实验均证实CGRP显著促进BMSC迁移。划痕实验显示，CGRP处理组划痕愈合速度更快，划痕面积显著减小。Transwell实验进一步证明CGRP促进BMSC向微孔膜底部迁移，迁移细胞数明显增加。CGRP8-37和H89均可有效抑制CGRP诱导的BMSC迁移，表明CGRP的促迁移作用同样依赖特异性受体激活并由PKA信号通路完全介导。

3.1.6 CGRP对BMSC成骨分化的影响

茜素红S染色显示，成骨诱导14天和21天后，CGRP处理的BMSC形成更多、更大、染色更深的橙红色钙化结节，矿化程度显著高于对照组。定量分析证实CGRP处理使矿化程度提高3.7倍和3.5倍。碱性磷酸酶（ALP）染色显示，成骨诱导4天和7天后，CGRP处理组ALP阳性染色（紫蓝色沉淀）更深更广泛，ALP活性显著增强（提高3.7倍和3.9倍）。CGRP8-37和H89处理均有效抑制CGRP诱导的矿化和ALP增强效应，证明CGRP的成骨促进作用需要受体结合和PKA通路功能激活。

3.1.7 CGRP通过cAMP/PKA/CREB通路调控BMSC成骨分化的机制研究

ELISA检测显示，CGRP处理BMSC 30分钟后细胞内cAMP浓度显著升高。CGRP受体拮抗剂CGRP8-37和PKA抑制剂H89可阻断CGRP诱导的cAMP水平升高。Western blot分析证实CGRP处理显著提升PKA磷酸化水平（p-PKA/总PKA比值）及其下游关键底物CREB磷酸化水平（p-CREB/总CREB比值）。qRT-PCR结果显示，CGRP处理显著上调成骨关键转录因子Runx2和Sp7（Osx）以及晚期成骨标志基因Spp1（OPN）和Bglap（OCN）的mRNA表达，同时细胞周期调控基因CyclinD1表达也显著上调。蛋白水平检测进一步验证Runx2、Osx、OPN、OCN和CyclinD1表达均被CGRP显著上调，而CGRP8-37和H89可抑制这些效应。这些结果形成完整证据链，确认CGRP通过cAMP/PKA/CREB信号通路激活促进BMSC成骨分化。

3.2 CGRP在体内促进大鼠牵张成骨

3.2.1 大体观察与影像学评估

大体形态检查显示，CGRP组牵张间隙几乎完全被坚硬的新生骨组织填充，形成相对坚固连续的骨桥结构，表面较光滑，颜色接近正常骨组织，与周围宿主骨紧密融合，骨愈合质量和形态优异。对照组牵张间隙多明显凹陷或仅少量纤维组织连接，新生骨填充不足。影像学动态观察结果与大体趋势一致：CGRP组在各时间点骨痂阴影更丰富、密度更高，6周时牵张间隙基本被成熟骨痂填充，骨密度高，小梁结构清晰，部分髓腔再通；对照组、CGRP+CGRP8-37和CGRP+H89组牵张间隙均未实现完全愈合。

3.2.2 Micro-CT评估新生骨质量与数量

Micro-CT三维重建显示，CGRP组牵张区新生骨量最丰富，小梁结构致密连接良好，形成相对完整坚固骨桥，髓腔再通程度较好。定量分析表明CGRP组骨矿物质密度（BMD）、骨体积分数（BV/TV）、骨小梁数量（Tb.N）和骨小梁厚度（Tb.Th）均显著高于其他组，而骨小梁分离度（Tb.Sp）显著降低，表明新生骨结构更紧密。CGRP8-37和H89处理均使各参数恢复至接近对照组水平，显著抑制CGRP的促进效应。

3.2.3 新生骨生物力学性能评估

三点弯曲试验显示，CGRP组再生股骨承受的极限载荷、失效能量和刚度均显著高于其他组，表明局部CGRP应用可显著增强新生骨生物力学性能（强度、刚度和韧性）。CGRP8-37和H89处理完全消除CGRP的力学增强作用，证实CGRP信号通路在骨再生功能恢复中的关键作用。

3.2.4 新生骨组织学与免疫组化评估

组织学染色显示CGRP组牵张区大量致密黑色矿化沉积，形成连续坚固骨桥，小梁形态成熟、排列规则；其他组仅见少量分散不规则矿化沉积，多数区域仍为未矿化纤维或软骨组织占据，骨连接差。免疫组化显示CGRP组新生骨组织（尤其活跃成骨细胞和年轻骨细胞）中Runx2、Osx、OPN、OCN以及p-PKA和p-CREB阳性表达水平均显著高于其他组，而CGRP8-37和H89处理显著削弱这些效应。结果与体外实验高度一致，表明CGRP在体内同样通过激活cAMP/PKA/CREB信号通路上调成骨标志物表达，促进高质量新生骨形成。

4 讨论

大段骨缺损修复仍是骨科临床主要挑战，牵张成骨（DO）技术虽提供有前景解决方案，但漫长巩固期和潜在并发症限制其临床获益。本研究通过系统体内外实验首次确认CGRP可通过激活cAMP/PKA/CREB信号通路有效促进BMSC增殖、迁移、抗凋亡和成骨分化，显著加速大鼠股骨DO模型中新生骨形成、矿化和力学性能改善。10^?8 M CGRP被确定为促进BMSC增殖最优浓度，且能有效抑制无血清培养诱导的凋亡，增强细胞生存能力。划痕和Transwell实验均证实CGRP显著促进BMSC迁移，可能通过增加DO区BMSC数量和募集为新生骨形成提供更丰富种子细胞。

关于成骨分化，CGRP显著增强ALP活性和钙化结节形成，上调关键成骨转录因子Runx2、Osterix及晚期标志物OPN、OCN。分子机制上，CGRP处理迅速升高BMSC内cAMP水平，显著促进PKA磷酸化激活及其下游底物CREB磷酸化。利用CGRP特异性受体拮抗剂CGRP8-37和PKA特异性抑制剂H89，发现CGRP诱导的BMSC增殖、抗凋亡、迁移、成骨分化及相关信号分子激活和基因表达均被显著抑制，证明cAMP/PKA/CREB信号通路在CGRP介导的BMSC生物学功能调控中起核心作用。

体内DO模型验证CGRP促骨再生效应：通过大体观察、系列影像学评估、Micro-CT分析、生物力学测试及组织学和免疫组化分析综合评价CGRP对DO新生骨影响。结果显示局部CGRP注射显著加速新生骨形成和矿化，改善骨量（BMD和BV/TV）和 microstructure，最终显著增强新生骨生物力学强度。更重要的是，体内实验同样证实cAMP/PKA/CREB信号通路在CGRP促骨再生中的关键性：CGRP处理组牵张区新生骨组织中p-PKA和p-CREB表达水平显著升高，伴随成骨标志物Runx2、Osterix、OPN、OCN表达上调；CGRP8-37或H89应用显著削弱CGRP促骨再生效应及相关信号分子激活和成骨标志物表达。

研究发现具有重要临床意义：当前DO治疗常需6-12个月巩固期，患者面临骨不连、器械失效和再骨折等风险。CGRP提升骨形成质量和加速巩固能力有望缩短治疗时长、改善患者结局。所证明的生物力学性能改善尤其相关，提示功能恢复增强和再骨折风险降低。

研究存在一定局限性：仅使用SD大鼠股骨DO模型，需在其他动物模型（如大动物模型）或不同骨缺损模型中进一步验证；主要聚焦cAMP/PKA/CREB信号通路，但CGRP机制可能涉及其他信号通路（如MAPK、Wnt/β-catenin通路）及其复杂交叉对话，值得深入探索；CGRP递送采用局部多次注射，未来探索更高效便捷的CGRP缓释递送系统可维持靶区有效浓度同时减少给药频率；观察终点主要聚焦6周巩固阶段，更长周期骨改建及其潜在影响需进一步研究。

5 结论

通过系统体内外实验，本研究首次证实CGRP可通过激活cAMP/PKA/CREB信号通路有效促进BMSC增殖、迁移、抗凋亡和成骨分化，显著改善大鼠股骨牵张成骨模型中新骨形成、矿化和力学性能。这些发现不仅深化了对CGRP在骨再生中机制的理解，也为开发基于CGRP的骨缺损修复策略提供重要实验证据和理论基础，表明CGRP作为内源性促骨再生因子具有广阔应用前景。