利用烟草BY-2细胞平台实现人源化IgA1的黏蛋白型O-糖基化工程

本综述系统阐述了在烟草BY-2细胞中实现人源化黏蛋白型O-糖基化的突破性研究。通过协同表达人源GalNAcT2和果蝇C1GalT1转移酶，成功在IgA1铰链区构建核心1 O-糖链结构，质谱分析证实植物特异性羟脯氨酸糖基化几乎完全消失。该研究为植物细胞生产具有精确糖基化修饰的治疗性抗体（如IgA1）提供了重要技术路径。

　　

引言：植物细胞悬浮培养体系的应用价值

植物细胞悬浮培养体系，特别是烟草BY-2细胞，已成为生物制药生产的重要平台。该系统兼具植物细胞的成本效益、安全性和符合药品生产质量管理规范（GMP）的工业合规性优势。目前已有多个人源酶制剂通过植物悬浮培养系统生产并获得监管机构批准，例如Elelyso^?和Elfabrio^?。治疗性蛋白通常需要糖基化修饰，这种修饰对其生物学特性具有决定性影响。

BY-2细胞的N-糖基化工程已取得显著进展。通过CRISPR/Cas9技术编辑α(1,3)-岩藻糖基转移酶和β(1,2)-木糖基转移酶基因，已成功消除非人源的核心α(1,3)-岩藻糖和β(1,2)-木糖结构，从而在ΔXT/FT BY-2细胞中生产出带有人源样复杂N-糖链的糖蛋白。

然而，在丝氨酸和苏氨酸残基上发生的GalNAc-O-糖基化（即黏蛋白型糖基化）作为人类最丰富的O-糖基化类型，在植物细胞中却完全缺失。虽然已有研究在本氏烟叶片或转基因BY-2细胞中成功实现了人源GalNAcT2（或GalNAcT4）对相关糖蛋白（如MUC1、MUC16、干扰素α2b、EPO或G-CSF）的功能性表达，但完整的O-糖基化通路工程仍待深入探索。

材料与方法：精密的多层次基因构建

研究采用Golden Gate植物工具包进行遗传构建，严格遵循模块化组装流程。通过Level 0到Level M的多层次载体组装，构建了包含人源GalNAcT2（NP_004472.1）和果蝇C1GalT1（NP_609258.1）的表达盒。这些表达盒在p35S启动子和tNOS终止子控制下进行表达。

为减少位置效应和基因沉默，研究引入了烟草Rb7支架附着区（SAR）遗传绝缘子。最终通过Level M载体pAGM8031组装成三种核心构建体：单独表达GalNAcT2、共表达GalNAcT2与C1GalT1、以及同时表达IgA1重链（HC）与轻链（LC）。

使用根癌农杆菌LBA4404 VirG介导的稳定转化方法对ΔXT/FT BY-2细胞进行转化，通过卡那霉素抗性筛选获得转基因细胞系。IgA1纯化采用Protein A琼脂糖珠亲和层析法，从无环糊精的D11b培养基培养物中提取目标蛋白。

蛋白质提取采用分级离心策略，分别获得总可溶性蛋白（TSP）和微粒体组分（MF）。蛋白质检测通过SDS-PAGE、Western blotting和凝集素 blotting实现，使用针对hGalNAcT2的多克隆抗体和HRP标记的二抗进行检测。

糖基化分析采用体外去糖基化实验，使用EndoH和PNGaseF处理样品。热稳定性通过差示扫描荧光法（DSF）测定，使用SYPRO Orange染料监测蛋白质解链温度。

质谱分析采用nanoLC-MS/MS技术，通过trypsin和GluC酶切处理样品，使用Orbitrap Exploris 480质谱仪进行数据采集，通过FreeStyle软件进行糖肽鉴定和相对定量。

结果：成功实现O-糖基化通路工程

稳定表达体系的建立

研究成功构建了两种不同的O-糖基化机制构建体：单独表达GalNAcT2（GalNAc）或共表达GalNAcT2与C1GalT1（Core1）。通过转化人源化ΔXT/FT BY-2细胞系，获得了多个转基因BY-2细胞系。

GalNAc-O-糖基化的启动通过在ΔXT/FT BY-2细胞中表达人源GalNAcT2实现。通过HPA凝集素 blotting分析发现，所有GalNAc系均显示明显的HPA信号，表明内源蛋白上的GalNAc附着。微粒体组分的Western blotting证实了hGalNACT2在所有测试的GalNAc细胞系中的表达。

通过共表达hGalNAcT2和DmC1GalT1实现了O-糖链向核心1结构的延伸。PNA凝集素 blotting显示，当表达DmC1GalT1时出现强烈的信号变异，表明核心1结构的成功生成。

IgA1 O-糖变体的生产与特性

将含有曲妥珠单抗可变区的人源化IgA1重链和轻链基因在工程化烟草天仙子PMA4启动子控制下进行克隆，并与GalNAcT2和C1GalT1表达盒组合成三种不同构建体：单独表达IgA1、共表达IgA1与GalNAcT2（IgA1G）、以及共表达IgA1与GalNAcT2和C1GalT1（IgA1C）。

通过Protein A琼脂糖珠纯化三种IgA1 O-糖变体。非还原性SDS-PAGE显示约160 kDa的条带对应完全组装的单体分子，以及120 kDa和100 kDa的附加条带，这种模式与在本氏烟叶片中表达的相同IgA1抗体相似。还原性SDS-PAGE证实了α重链和κ轻链的存在，并观察到可能对应α链蛋白酶解降解产物的两个附加条带。

热稳定性分析显示三种IgA1 O-糖变体的熔解温度均约为73°C，与本氏烟叶片中生产的其他IgA1观察到的数值相似，表明糖基化修饰未显著影响蛋白质的热稳定性。

N-糖基化状态的特征

IgA1具有高度糖基化特性，其19个残基的铰链区在人类血清中带有3-6个唾液酸化的核心1 O-糖链。此外，IgA1还含有两个N-糖基化位点：CH2中的N263和尾片中的N459。

通过PNGaseF和EndoH体外去糖基化评估ΔXT/FT BY-2细胞中纯化IgA1的N-糖基化状态。PNGaseF处理的样品显示α重链的轻微分子量偏移，而EndoH处理则无此现象，表明N-糖链为缺乏核心α(1,3)-岩藻糖的复杂或杂合类型。

LC-MS/MS分析显示，三种O-糖变体的N263位点（ANLTCTLTGLR）整体谱图大致相似，其中双天线复杂型结构GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂（GnGn）和GlcNAc₁Man₃GlcNAc₂（GnM/MGn）为最丰富的N-糖（50-75%）。检测到的其他N-糖包括不同的寡甘露糖（Man4至Man8）和截短的N-糖Man₃GlcNAc₂（MM）。谱图还显示少量Man₂GlcNAc₂（MU）（约5%）和单个Gn（<3%）糖。未检测到不含N-糖的ANLTCTLTGLR肽段，表明N263位点完全占据。

尾片位点（LAGKPTHVNVSVVMAE）的糖基化分析结果质量较差，该糖基化位点位于蛋白质C末端的无序区域，在本氏烟中表达的IgA1中发现被切割和糖基化不足。

O-糖基化分析的重大发现

通过抗人IgA（α重链）抗体以及HPA和PNA凝集素对纯化IgA1的印迹分析评估每个IgA1 O-糖变体的糖链特性。凝集素印迹明确表明，当在ΔXT/FT BY-2细胞中共表达相应酶时，IgA1带有黏蛋白型O-糖链。

PNA探针印迹显示，共表达hGalNAcT2和DmC1GalT1对于检测IgA1C α链上的核心1 O-糖链是必需的。HPA探针印迹表明，表达hGalNAcT2对于检测IgA1G α链上的GalNAc残基是必需的，并且当共表达hGalNAcT2和DmC1GalT1时，GalNAc和核心1 O-糖链可共存于IgA1C上。

质谱分析揭示了铰链区肽段（HYTNPSQDVTVPCPVPSTPPTPSPSTPPTPSPSCCHPR）的O-糖基化状态。当IgA1单独在ΔXT/FT BY-2细胞中表达时，铰链区被植物特异性的羟脯氨酸糖基化重度修饰。超过90%的肽段被至少一个Hyp修饰，80%被最多18个戊糖糖基化，最丰富的糖肽为6 Hyp-9、10、12和13戊糖。

当在ΔXT/FT BY-2细胞中共表达hGalNAcT2和DmC1GalT1时，检测到对应HexNAc和Hex添加的质量偏移，支持IgA1铰链区GalNAc-O-糖基化的启动和延伸。3-5个O-位点被占据，与该IgA1在HEK 293中观察到的糖基化状态一致。此外，所有鉴定到的肽段均被修饰，并显示Pro羟化强烈减少，戊糖几乎完全消失。

讨论：植物细胞糖基化工程的突破与挑战

本研究首次在烟草BY-2细胞中实现了完整的黏蛋白型O-糖基化工程。虽然先前已有研究在转基因BY-2细胞中引入了黏蛋白型O-糖基化的第一个GalNAc步骤，但本研究通过协同表达策略实现了完整的核心1结构构建。

研究结果表明，单独表达hGalNAcT2足以在转基因ΔXT/FT BY-2细胞中启动内源蛋白和重组人IgA1铰链区的GalNAc O-糖基化。这一发现与先前在本氏烟叶片中的研究结果一致，表明UDP-GalNAc浓度在BY-2细胞高尔基体中足以支持高效的GalNAc O-糖基化。

通过共表达hGalNAcT2与DmC1GalT1（一种不需要特定分子伴侣COSMC的核心1 β1-3半乳糖基转移酶），在转基因ΔXT/FT BY-2细胞中成功实现了核心1 O-糖链结构的生成。研究检测到含有3、4和5个核心1 O-糖链结构的糖肽，以及同时含有核心1和Tn O-糖的糖肽。核心1 O-糖的形成似乎非常高效，大多数GalNAc被半乳糖延伸（Hex/HexNAc残基比为0.93）。

值得注意的是，与本氏烟叶片中表达核心1 O-糖基化通路的IgA1 O-糖基化分析不同，本研究未检测到未修饰的铰链糖肽，表明当hGalNAcT2和DmC1GalT1在转基因BY-2细胞中组成型表达时，GalNAc-O糖基化非常高效。这种差异可能源于BY-2细胞细胞外培养基纯化的IgA1C蛋白样品比来自整个叶片提取物的IgA1蛋白样品更均质，后者包含分泌途径中所有IgA1蛋白的混合物。

此外，铰链区用黏蛋白型O-糖修饰导致铰链区Hyps丰度强烈减少，表明Pro羟化在一定程度上被阻止。然而，Pro羟化和进一步的Hyp糖基化仍然发生，这可能对抗体的特性产生不利影响。一种有前景的策略是沉默P4Hs（负责Pro羟化的酶），这一策略正在本氏烟叶片中进行探索。

转基因BY-2悬浮培养物的使用通过从细胞外培养基开始并提供定制培养基组成的可能性而促进下游 processing，这可以补充遗传O-糖工程。本研究为在植物细胞中生产具有精确糖基化修饰的治疗性抗体提供了重要技术路径，展示了植物细胞平台在生物制药领域的巨大潜力。