NUFIP1介导的核糖体自噬通过cGAS-STING通路缓解脓毒症CD4+T淋巴细胞PANoptosis

本研究针对脓毒症中CD4+T淋巴细胞免疫功能障碍的核心问题，揭示了NUFIP1介导的核糖体自噬通过调控ZBP1-PANoptosome形成和cGAS-STING信号通路，显著减轻T细胞PANoptosis（凋亡-坏死-焦亡复合程序性死亡），改善免疫抑制状态和多器官损伤，为脓毒症免疫精准治疗提供了新靶点。

　　

脓毒症作为一种危及生命的病理状态，其核心特征是由宿主对感染反应失调引发的多器官系统衰竭，构成了全球健康的重大挑战。流行病学数据显示，全球每年有4890万新发病例和110万相关死亡。尽管在重症医学领域取得了诸多进展，脓毒症导致的免疫抑制仍然是晚期发病和死亡的关键决定因素。作为适应性免疫的核心调控者，T淋巴细胞通过分泌细胞因子、抗原呈递和调节效应细胞功能来维持免疫稳态。越来越多的临床和临床前研究表明，T细胞功能障碍与脓毒症免疫失调存在因果关系，其特征是CD4⁺T细胞数量和增殖活性降低。

程序性细胞死亡(PCD)是机体发育和稳态平衡的基本调控机制，在病原体清除和免疫监视中发挥着不可或缺的防御作用。越来越多的证据表明，不同PCD模式的分子效应器形成了一个相互连接的网络，其中单一病原性或无菌性刺激可通过交叉对话通路同时激活多个PCD级联反应。PANoptosis作为细胞死亡研究领域的新概念，其特征是通过共享的形态学和分子特征同步执行焦亡、凋亡和坏死性凋亡，为理解协调性细胞死亡程序提供了统一框架。尽管在多种疾病中发现了PANoptosis的致病作用，但其在免疫细胞群体中的功能作用，特别是在脓毒症进展过程中CD4⁺T淋巴细胞PANoptosis动力学和调控网络的特征，仍然缺乏深入研究。

自噬通过降解错误折叠蛋白和回收受损细胞器，作为维持细胞稳态的关键哨兵机制。临床前研究表明，脓毒症中细胞器特异性自噬的代偿性上调与多器官功能改善和生存结局相关。然而，在这些发现强调自噬网络细胞保护作用的同时，核糖体自噬(ribophagy)在脓毒症相关免疫代谢重编程中的功能层次和时空调控仍然是个谜。核糖体是维持翻译保真度不可或缺的细胞器，翻译停滞或核糖体故障诱导的核糖体碰撞会导致不完全合成的多肽链和核糖体RNA(rRNA)泄漏到细胞质中。泄漏的rRNA被环鸟苷酸-腺苷酸合成酶(cGAS)识别为危险信号，其带负电荷的磷酸骨架直接与cGAS带正电荷的DNA结合域结合，触发cGAS构象变化，催化第二信使2′,3′-环鸟苷酸-腺苷酸(cGAMP)的合成，随后激活干扰素基因刺激因子(STING)–TANK结合激酶1(TBK1)–干扰素调节因子3(IRF3)通路，驱动炎症因子表达。

为了应对这种威胁，真核细胞进化出了分层级的核糖体质量控制系统(RQCS)，在核糖体生命周期中协调从生物发生到调节周转的核糖体监视。在该系统中，核糖体自噬已成为专门用于核糖体清除的关键选择性自噬。核脆性X智力迟钝相互作用蛋白1(NUFIP1)作为其认知受体的鉴定，阐明了哺乳动物核糖体自噬的机制基础，为通路调控提供了分子靶点。先前研究表明，NUFIP1依赖性核糖体自噬对脓毒症挑战后的CD4⁺T淋巴细胞免疫反应具有强大的细胞保护作用。结合最近提出的PANoptosis概念和免疫细胞中多种相互连接的PCD模式的同时存在，研究人员假设NUFIP1介导的核糖体自噬可能在脓毒症期间CD4⁺T淋巴细胞的PANoptosis中发挥调节作用。

为了验证这一假设，研究人员在体内使用盲肠结扎穿孔(CLP)模型，在体外使用脂多糖(LPS)刺激的细胞来模拟脓毒症条件。通过慢病毒转染和生成Cd4^creNufip1^fl/fl动物来操纵NUFIP1，研究其对CD4⁺T淋巴细胞PANoptosis、免疫活性、多器官损伤和生存率的影响。随后进行蛋白质组测序以鉴定关键分子和潜在信号通路。通过多核糖体分析检测核糖体碰撞，使用免疫共沉淀(Co-IP)探索NUFIP1与关键分子之间的相互作用。进行小分子抑制剂拯救实验以进一步阐明精确的分子机制。此外，从脓毒症和非脓毒症患者的外周血样本中分离CD4⁺T淋巴细胞，验证核糖体自噬和PANoptosis在临床病例中的意义。

关键技术方法包括：使用LPS刺激的Jurkat T细胞和CLP诱导的脓毒症模型；慢病毒转染技术敲低或过表达NUFIP1；条件性基因敲除小鼠模型(Cd4^creNufip1^fl/fl)；TMT定量蛋白质组学分析；多核糖体分析技术；免疫共沉淀(Co-IP)实验；小分子抑制剂SN-011干预；临床样本来自10例脓毒症患者和10例非脓毒症患者的外周血CD4⁺T淋巴细胞。

PANoptosis of CD4⁺ T lymphocytes in sepsis

研究发现 prolonged LPS stimulation和CLP诱导的脓毒症导致CD4⁺T淋巴细胞凋亡比率、SYTOX-Green坏死比率和关键PANoptosis相关蛋白水平出现先升高后降低的 transient变化。激光共聚焦显微镜检测显示，脓毒症期间T细胞内ASC/caspase-8/RIPK3等关键PANoptosis蛋白表达显著增加，且这些蛋白的共定位更加明显，具有明显的PANoptosomes。Western blot结果证实脓毒症组CD4⁺T淋巴细胞PANoptosis相关蛋白表达显著升高。ELISA结果显示脓毒症组CD4⁺T淋巴细胞培养上清和小鼠血清中焦亡相关细胞因子和坏死相关细胞因子LDH分泌显著增加。透射电镜显示脓毒症组CD4⁺T淋巴细胞表现出焦亡、凋亡和坏死性凋亡的 distinct形态特征。

Sepsis induces activation of ribophagy in CD4⁺ T lymphocytes

通过建立慢病毒转染模型，研究人员成功实现了Jurkat T细胞中NUFIP1基因的敲低和过表达。LPS刺激24小时后，Jurkat T细胞中核糖体自噬受体NUFIP1、溶酶体特异性标志蛋白LAMP-2和自噬蛋白LC-3B的表达和共定位显著增强。在体外LPS刺激和体内CLP模型的脾脏CD4⁺T淋巴细胞中也观察到类似现象。脓毒症后CD4⁺T淋巴细胞中核糖体自噬特异性受体NUFIP1和自噬相关蛋白LC-3B表达显著，而核糖体自身蛋白RPL7、RPL23和RPL26表达相应降低。透射电镜证实脓毒症组CD4⁺T淋巴细胞中存在含有降解核糖体的典型双层自噬体，进一步证明了核糖体自噬的激活。

NUFIP1-mediated ribophagy alleviates CD4⁺ T lymphocyte ZBP1-PANoptosis in sepsis

激光共聚焦显微镜显示，NUFIP1敲低后PANoptotic蛋白ASC/caspase-8/RIPK3的表达和共定位显著增强。Western blot结果显示NUFIP1敲低激活了Jurkat T细胞中的PANoptosis相关蛋白，而过表达则降低了这些蛋白水平。透射电镜观察显示NUFIP1敲低的Jurkat T细胞出现明显的PANoptotic形态改变。在Jurkat T细胞中定量ZBP1、AIM2、RIPK1和NLRP12这些PANoptosomes形成的关键蛋白发现，LPS在一定程度上增加了NUFIP1、NLRP12和ZBP1蛋白水平。沉默NUFIP1基因导致NUFIP1表达显著降低，而NLRP12和ZBP1水平增加，RIPK1和AIM2表达保持相对恒定。通过生成条件敲除小鼠模型(Cd4^creNufip1^fl/fl)及其对照小鼠(Nufip1^fl/fl)，发现NUFIP1敲除后，无论LPS刺激还是CLP操作，ZBP1和cGAS-STING相关蛋白均显著增加。免疫共沉淀实验证明NUFIP1和ZBP1在Jurkat T细胞和小鼠脾脏原代CD4⁺T淋巴细胞中存在显著相互作用。

Impact of conditional deletion of NUFIP1 on immune response of CD4⁺ T lymphocytes, organ injury, and the 1-week survival rate of mice in sepsis

使用Cd4^creNufip1^fl/fl小鼠探索条件性NUFIP1敲除对脓毒症中CD4⁺T细胞免疫功能、多器官损伤和预后的影响。CCK-8检测显示脓毒症后Flox和cKO组脾脏CD4⁺T淋巴细胞增殖活性显著降低。ELISA表明脓毒症导致Th2分化偏向免疫抑制状态，NUFIP1 cKO后脾脏CD4⁺T淋巴细胞IL-2和IFN-γ分泌进一步减少，强化了Th2分化趋势。流式细胞术显示CLP术后外周血单个核细胞中CD3⁺T和CD3⁺CD4⁺T淋巴细胞比例显著降低，NUFIP1敲除后下降更明显。CD4⁺T细胞亚群分析显示LPS刺激和CLP诱导的脓毒症导致Th2/Th1细胞亚群比例升高，具有免疫抑制功能的Treg和Th17细胞亚群百分比也显著增加。NUFIP1 cKO后上述淋巴细胞亚群比例的改变进一步加剧。H&E染色显示NUFIP1 cKO后心、肺、肝、肾组织损伤加重。生存率分析显示CLP后1周生存率显著降低，Cd4^creNufip1^fl/fl小鼠相比Nufip1^fl/fl小鼠进一步下降。

cGAS-STING signaling is critical for NUFIP1-mediated ribophagy in regulating CD4⁺ T lymphocyte PANoptosis upon sepsis challenge

蛋白质组学分析鉴定出904个上调蛋白和954个下调蛋白。GO分析显示NUFIP1敲低影响翻译调控、核糖体生成、自噬、蛋白质合成、折叠和降解等生物过程。KEGG通路富集分析显示NUFIP1敲低后，与病原体感染、内质网蛋白加工、自噬、凋亡和cGAS-STING信号相关的信号通路显著富集。结合前20个差异表达蛋白和KEGG通路富集分析，推断cGAS-STING信号通路可能在NUFIP1介导的核糖体自噬调控脓毒症CD4⁺T淋巴细胞PANoptosis中发挥潜在作用。Western blot分析显示LPS刺激导致NUFIP1、ZBP1和cGAS-STING相关蛋白表达上调。敲低NUFIP1基因导致NUFIP1表达显著降低，而ZBP1蛋白和cGAS-STING信号相关蛋白水平显著增加。过表达NUFIP1基因增强NUFIP1表达但降低ZBP1和cGAS-STING通路蛋白水平。

Polysome profiling and Co-IP reveal the molecular mechanism underlying NUFIP1-mediated ribophagy in activating cGAS-STING signaling

多核糖体分析用于评估脓毒症CD4⁺T淋巴细胞中的核糖体碰撞事件。LPS刺激的Jurkat T细胞和CLP小鼠分离的CD4⁺T淋巴细胞相比未处理对照组表现出显著升高的核糖体碰撞频率。遗传调控实验显示siRNA介导的NUFIP1敲低加剧了核糖体碰撞，而慢病毒NUFIP1过表达有效缓解了这种反应。免疫共沉淀实验检测NUFIP1和STING之间的物理相互作用，在Jurkat T细胞和小鼠CD4⁺T淋巴细胞中观察到显著的NUFIP1-STING复合物形成。

Impact of cGAS-STING modulation on PANoptosis and immune function of CD4⁺ T cells, multiple organ injury, and 1-week survival in septic mice

使用特异性小分子抑制剂SN-011调节相关通路，发现增加SN-011浓度导致STING蛋白表达逐渐减弱，下游分子TBK1和IRF3也呈现类似趋势。与Flox组相比，NUFIP1 cKO组血清细胞因子水平显著升高，SN-011处理后两组这些细胞因子血清水平均显著降低。Western blot评估SN-011对脓毒症期间CD4⁺T淋巴细胞信号通路和PANoptosis相关蛋白表达的影响，显示SN-011处理显著抑制cGAS-STING相关蛋白，伴随PANoptosis相关蛋白表达减少。cGAS-STING信号通路抑制通过SN-011显著减轻脓毒症中T细胞PANoptosis，同时恢复增殖和分泌功能。与未处理脓毒症小鼠相比，SN-011治疗小鼠器官损伤严重程度显著降低，1周生存率显著改善。

Clinical significance of ribophagy and PANoptosis in peripheral blood CD4⁺ T lymphocytes of individuals with sepsis

临床验证研究脓毒症患者外周血CD4⁺T淋巴细胞中PANoptosis和核糖体自噬的发生情况。TUNEL和Hoechst 33258染色检测凋亡，SYTOX-Green染色检测细胞坏死，结果显示脓毒症患者CD4⁺T淋巴细胞凋亡和坏死百分比显著增加。Western blot评估患者外周血CD4⁺T淋巴细胞中核糖体自噬和PANoptosis相关蛋白，发现脓毒症患者各种核糖体自噬和PANoptosis标志物显著升高，核糖体蛋白和抗凋亡蛋白Bcl-2水平降低。脓毒症患者CD4⁺T淋巴细胞功能分析显示增殖和分泌活性降低，Th2极化，CD3⁺T和CD3⁺CD4⁺T淋巴细胞比例减少，表明这些患者处于明显的免疫抑制状态。

研究结论表明，脓毒症可诱导CD4⁺T淋巴细胞发生PANoptosis，而NUFIP1介导的核糖体自噬作为一种保护机制，能够减轻免疫功能障