新型同型精氨酸环肽Pioamide的发现：一种源自线虫共生体Photorhabdus khanii的铜绿假单胞菌选择性抗菌剂

本研究从昆虫病原细菌Photorhabdus khanii HGB1456中发现新型环肽抗生素pioamide，该化合物对铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）表现出独特的选择性抗菌活性。通过全基因组测序发现其耐药性与pmrB基因突变相关，机制研究表明其作用方式不同于多粘菌素（colistin），且不受外排泵（efflux pumps）和孔蛋白（porins）影响。该研究为开发针对多重耐药革兰氏阴性菌（Gram-negative）的窄谱抗生素提供了新策略。

　　

ABSTRACT

革兰氏阴性菌的外膜结构形成物理屏障，阻碍抗生素进入细胞，这使得开发有效杀灭革兰氏阴性病原体的抗生素极具挑战性。昆虫病原细菌Photorhabdus物种能产生多种生物活性分子，因此被视为新型抗生素的重要来源。本研究从Photorhabdus khanii HGB1456菌株的培养上清液中鉴定出一种新型抗假单胞菌抗生素pioamide，该菌株同时也能产生选择性杀灭革兰氏阴性菌的darobactin。Pioamide是一种分子量为704的五肽抗生素，对铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）表现出选择性活性，但对其他细菌或人类细胞系无活性。通过对自发耐pioamide的铜绿假单胞菌突变体进行全基因组测序，发现其pmrB基因发生突变。pmrB编码双组分调控系统的反应调节因子，负责修饰革兰氏阴性菌的脂多糖（LPS）组成，从而赋予细菌对pioamide的抗性。此外，铜绿假单胞菌PAO1野生型与突变株PΔ6-Pore（该突变株过表达孔蛋白且缺失六个外排泵）对pioamide的敏感性相同，表明孔蛋白和外排泵对pioamide的活性无显著影响。这些结果提示pioamide可能靶向铜绿假单胞菌的细胞表面，或通过物种特异性摄取机制进入细胞。本研究凸显了Photorhabdus菌株作为抗革兰氏阴性病原体抗生素发现来源的巨大潜力。

IMPORTANCE

多重耐药革兰氏阴性菌的兴起对全球公共卫生构成日益严重的威胁。窄谱抗生素可最大程度减少对宿主微生物群的破坏，并降低非靶向细菌产生耐药性的风险。在抗菌药物发现领域，开发对铜绿假单胞菌有效的化合物尤其具有挑战性。尽管已知Photorhabdus物种能产生多种抗生素，但其潜力尚未被充分挖掘。本研究对Photorhabdus khanii HGB1456的高浓度培养提取物进行差异筛选，发现了pioamide——一种对铜绿假单胞菌具有异常选择活性的新型环肽。pmrB突变赋予铜绿假单胞菌对pioamide的抗性，但其作用机制与同样涉及pmrB突变抗性的多粘菌素不同。这些发现强调了Photorhabdus物种作为物种特异性抗生素来源的未开发潜力，并凸显了差异筛选在发现具有靶向抗菌活性化合物方面的实用性。

INTRODUCTION

我们正面临抗生素耐药性危机。铜绿假单胞菌作为一种革兰氏阴性机会致病菌，拥有发达的多药外排泵系统和作为大分子屏障的外膜，这些特性使其成为最难用抗生素治疗的病原体之一，尤其是在多重耐药（MDR）铜绿假单胞菌感染的情况下。世界卫生组织已将铜绿假单胞菌列为需要新型抗生素的“高度优先”病原体。根据美国疾控中心2019年抗生素耐药性威胁报告，住院患者中发生32,600例感染，其中2,700例因MDR铜绿假单胞菌感染导致死亡。

昆虫病原细菌Photorhabdus物种已知能产生多种生物活性化合物，包括抗生素。然而，目前尚无Photorhabdus来源的抗生素投入实际使用。窄谱抗生素更适用于药物开发，因为它们可降低在非靶向细菌中产生耐药突变体的风险，并最大限度地减少对肠道微生物群（包括乳酸杆菌和双歧杆菌等有益细菌）的破坏。铜绿假单胞菌主要与呼吸道和全身感染相关，但全身或口服给药的抗生素会分布全身，影响肠道 microbiota。因此，开发对铜绿假单胞菌具有选择活性的抗生素对于减轻对共生微生物群的附带损害至关重要。

我们最近引入了抗生素发现的差异筛选方法，通过比较细菌培养上清液中化合物对几种病原体的活性，来识别对特定病原体具有选择活性的化合物。通过将差异筛选与Photorhabdus菌株作为筛选源相结合，我们发现了多种对革兰氏阴性病原体具有选择活性的抗生素。例如，分别从Photorhabdus khanii和Photorhabdus australis发现的darobactins和dynobactins，通过抑制负责将新生外膜蛋白插入外膜的BamA蛋白，选择性杀灭革兰氏阴性病原体。从Photorhabdus luminescens发现的3′-氨基-3′-脱氧鸟苷（ADG）作为一种前药，模拟GTP并通过中断转录选择性杀灭特定革兰氏阴性菌（如大肠杆菌和肺炎克雷伯菌）。最近，我们从Photorhabdus laumondii的培养上清液中重新发现了3,6-二羟基-1,2-苯并异恶唑（DHB），这是一种已知的广谱抗革兰氏阴性菌抗生素，其通过与4-羟基苯甲酸辛癸烯基转移酶结合并抑制泛醌生物合成途径发挥作用。

这些发现强调了Photorhabdus菌株作为多种抗革兰氏阴性抗生素来源的潜力，并表明差异筛选与Photorhabdus菌株的结合是发现具有病原体选择活性新型抗生素的有前途策略。此外，大多数Photorhabdus菌株在其基因组中含有20个以上的生物合成基因簇（BGCs），其中大多数簇编码未知化合物。我们假设Photorhabdus菌株可能产生除darobactins、dynobactins、ADG和DHB之外的其他对革兰氏阴性菌具有选择活性的抗生素。本研究报道了pioamide的发现，这是一种对铜绿假单胞菌具有选择活性的新型环五肽抗生素。Pioamide表现出窄谱活性，可能作用于铜绿假单胞菌的细胞表面或通过物种特异性摄取机制被吸收。

MATERIALS AND METHODS

Isolation of pioamide

将P. khanii HGB1456在28°C、200 rpm摇动的2升锥形瓶中的1升胰蛋白酶大豆肉汤中培养10-14天。培养后，通过8,000 × g离心10分钟去除细菌细胞，得到的培养上清液使用XAD16N树脂进行半纯化，然后进行阳离子交换色谱（SP Sepharose XL）纯化。活性组分用50 mM乙酸铵缓冲液（pH 7.0）洗脱。将相当于500 mL至1 L培养上清液的高度浓缩的半纯化提取物4 mL样品，使用C18柱进行反相高效液相色谱（HPLC）分析。HPLC条件如下：溶剂A为含0.1%甲酸（FA）的Milli-Q水；溶剂B为含0.1% FA的乙腈（ACN）。初始2%溶剂B浓度保持7分钟，然后在9 mL/min流速下在23分钟内线性梯度至40%。在254 nm进行紫外检测，每20秒收集馏分。活性馏分在17至19分钟之间洗脱。将第一次HPLC的活性馏分使用C18柱进一步纯化，HPLC条件为：溶剂A为50 mM乙酸铵（pH 8.0）；溶剂B为ACN。初始2%溶剂B浓度保持2分钟，然后在1 mL/min流速下在20分钟内线性梯度至95%溶剂B。在254 nm进行紫外检测。活性化合物在8.5分钟洗脱。将纯化的活性馏分使用C18柱进行最终一轮纯化，HPLC条件为：溶剂A为含0.1% FA的Milli-Q水；溶剂B为含0.1% FA的ACN。初始2%溶剂B浓度保持2分钟，然后在1 mL/min流速下在20分钟内线性梯度至95%溶剂B。在280 nm进行紫外检测。纯活性化合物在7分钟洗脱。

通过扩散测定法测定HPLC馏分和pioamide的活性。将指数生长期的铜绿假单胞菌PAO1、大肠杆菌MG1655和金黄色葡萄球菌HG003（OD₆₀₀ 0.1–0.9）稀释至OD₆₀₀ 0.03，用于覆盖Mueller Hinton II琼脂（MHIIA）平板。去除多余培养物后，将平板在洁净工作台上干燥，并将HPLC馏分或pioamide点样于MHIIA平板上。平板在37°C培养过夜，通过观察每个点周围的抑菌圈来评估抗菌活性。

Elucidation of structure

一维¹³C核磁共振（NMR）谱在Bruker AVANCE II 400上获取，配备5 mm BBFO探头；所有其他NMR数据在Bruker AVANCE II 700 MHz NMR光谱仪上记录，配备5 mm TXI探头。将Pioamide制备在500 μL DMSO-d₆中。光谱在300 K下获得，包括¹H (zg)、¹³C (zgpg30)、COSY (cosygpmfqf)、TOCSY (dipsi2etgpsi)、¹H–¹⁵N HSQC (hsqcetf3gpsi)、¹H–¹³C HSQC (hsqcedetgpsisp2.3)、¹H–¹³C HMBC (hmbcgplpndprqf)和ROESY (roesyphpp.2)。使用Thermo Scientific LTQ-Orbitrap质谱仪进行高分辨率质谱分析，配备电喷雾电离（ESI）源，在正离子模式下运行（FTMS ESI正离子模式，全扫描MS范围：m/z 150–2,000）。通过注射器进样引入化合物。喷雾溶剂为水和乙腈（80:20, vol/vol）的二元混合物，含0.1% FA。

Minimum inhibitory concentration and cytotoxicity assays

使用微量肉汤稀释法测定最低抑菌浓度（MIC）和细胞毒性。将铜绿假单胞菌菌株、大肠杆菌MG1655、鲍曼不动杆菌ATCC17978、肺炎克雷伯菌ATCC700603和金黄色葡萄球菌HG003的过夜培养物在MHIIB中1:100稀释，并在37°C、220 rpm通气培养。对于铜绿假单胞菌PΔ6-Pore突变株，该菌株在30 μg/mL庆大霉素存在下培养，并通过在MHIIB中添加100 μM IPTG诱导孔蛋白表达。将指数期培养物（OD₆₀₀ 0.1–0.9）稀释至OD₆₀₀ 0.001（约5 × 10⁵ CFUs/mL），取100 μL等分试样转移到圆底96孔板中，其中含有进行两倍系列稀释的pioamide。在37°C培养过夜后，将pioamide的MIC确定为显著抑制细菌生长的最低浓度。使用微板Alamar Blue测定（MABA/刃天青）测定细胞毒性。将指数生长的FaDu咽鳞状细胞癌（ATCC HTB-43）和HepG2肝细胞癌（ATCC HB-8065）细胞系在补充10%胎牛血清的Eagle最低必需培养基中培养，然后接种到96孔平底组织培养板中，在37°C、5% CO₂下培养。24小时后，吸出培养基并更换为含有测试化合物（在100 μL培养基中进行两倍系列稀释）的新鲜培养基。在37°C、5% CO₂下培养72小时后，向每孔添加刃天青至终浓度0.15 mM。3小时后，使用BioTek Synergy H1微孔板读数仪在544和590 nm测量吸光度值。所有MIC和细胞毒性测定至少进行三次重复。

Fluorescence microscopy

对于延时显微镜，将铜绿假单胞菌PAO1在MHIIB中培养过夜至稳定期，第二天以1:100接种到新鲜MHIIB中，在37°C生长2小时。将细胞在MHIIB中稀释10倍，置于含有pioamide（8× MIC）、FM4-64（10 μg/mL）和SYTOX Green（0.5 μM）的1.5%低熔点琼脂糖MHIIB垫上，并使用Nikon Ti2-E荧光显微镜和100×油浸物镜观察。通过分别在480和550 nm激发，依次收集SYTOX Green和FM4-64的荧光信号，同时获取相衬图像。使用恒温腔在实验期间保持37°C温度。使用NIS-Elements每30分钟获取一次图像，分辨率为2,048 × 2,048。图4中显示的图像经过增强对比度处理，并使用HyperStackReg插件校正x-y漂移。

Mutation analysis

从指数期培养物中获取铜绿假单胞菌PAO1细胞，用PBS洗涤，然后以6.6 × 10⁸–7.2 × 10⁸ CFUs/板的密度接种到含有四倍MIC pioamide的HPLC馏分的MHIIA平板上。在37°C培养2天后，将自发的pioamide抗性突变株重新划线到含有四倍MIC pioamide的MHIIA平板上以评估抗性的稳定性。实验使用三个独立培养物进行。基因组测序和变异调用在微生物基因组测序中心（MiGS, Pittsburgh）进行。使用Illumina NextSeq 550进行配对末端读长（2× 150 bp）的全基因组测序，并使用铜绿假单胞菌基因组参考（NCBI: GCF_000006765.1）进行变异调用。

RESULTS AND DISCUSSION

Discovery of pioamide from P. khanii culture

P. khanii HGB1456是新型抗生素darobactin首个成员的生产者，该抗生素由沉默的BGC编码。使用antiSMASH对P. khanii HGB1456进行基因组分析显示，该菌株含有27个BGC，包括编码darobactin的簇。其中20个BGC与已知抗生素的相似性较低或几乎没有。基于此观察，我们假设P. khanii HGB1456有潜力产生其他选择性杀灭革兰氏阴性菌的抗生素，这些抗生素可能产量较低或由沉默BGC编码，如darobactin的情况。为验证此假设，我们使用合成树脂XAD16N对P. khanii HGB1456的培养上清液进行半纯化，然后进行阳离子交换色谱。将半纯化样品干燥后，重悬于小体积Milli-Q水中， resulting in a 250-fold concentration compared with that of the original supernatant，从而能够检测来自沉默BGC或产量较低化合物的抗生素活性。将此高度浓缩的样品进行HPLC，然后对洗脱液进行分馏。每个馏分测试了对代表性革兰氏阴性菌大肠杆菌MG1655和铜绿假单胞菌PAO1以及作为反筛选对照的革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌HG003的抗菌活性。我们观察到几个馏分仅对铜绿假单胞菌PAO1有活性。通过HPLC结合生物测定指导的分馏进一步纯化， leading to the isolation of a pure active compound that exhibited a distinct zone of inhibition exclusively against铜绿假单胞菌。液相色谱-串联质谱分析显示分子离子为m/z 705.42 [M+H]⁺。值得注意的是，该分子量与天然产物数据库Antibase中列出的任何已知化合物都不匹配。这些数据表明P. khanii HGB1456产生了一种新型抗生素。

Determination of pioamide structure

Pioamide以白色粉末形式获得。其结构通过MS光谱和NMR光谱分析确定。高分辨率电喷雾电离质谱（HRESIMS）（m/z 705.4208 [M+H]⁺）结合NMR数据表明pioamide的分子式为C₃₀H₅₂N₁₄O₆（计算值[M+H]⁺ = 705.4267）。对¹H、¹³C和HSQC NMR谱的分析表明存在两个甲基（δH/C 0.78/14.8和0.82/11.4）、九个亚甲基（δH 1.02–2.83/25.5–31.3和2.41/36.7）、一个脂肪族次甲基（δH/C 1.72/37.1）和两个含氮亚甲基（δH/C 3.01/40.4和3.03/40.3）。存在大量可交换质子（δH 6.92–8.71）和五个次甲基基团（δH/C 3.88/55.1, 4.08/55.7, 4.08/56.5, 4.31/53.1, 和4.36/52.2）的低场化学位移 strongly indicated the peptidic nature of the compound consisting of five amino acids。对2D NMR数据（COSY、HMBC和ROESY）的全面分析确定了每个氨基酸的结构。从酰胺质子NH-16（δH 8.02）到甲基质子H₃-19（δH 0.82）通过两个次甲基H-16和H-17、甲基H₃-20和亚甲基H₂-18的质子自旋系统在COSY谱中观察到，以及从H-17到C-15的HMBC相关揭示了异亮氨酸残基的存在。使用质子自旋系统（NH-22到H₂-23）以及从H₂-23和NH₂-24到酰胺羰基碳C-24（δC 170.7）的HMBC相关确定了天冬酰胺残基。两个紧密相邻的羰基C-7（δC 157.3）和C-14（δC 157.3）在特征化学位移处存在，表明存在两个精氨酸中观察到的胍基。COSY相关的进一步详细分析揭示了两个自旋系统（NH-2/H-2/H₂-3/H₂-4/H₂-5/H₂-6/NH-6和NH-9/H-9/H₂-10/H₂-11/H₂-12/H₂-13/NH-13），由一个4碳脂肪族侧链组成。此外，从NH-6和NH-13到C-7和C-14的清晰HMBC相关分别确定了两个同型精氨酸残基的结构。在COSY谱中观察到的剩余质子自旋系统（NH-26/H-26/H₂-27）通过关键的HMBC相关从H₂-27到烯碳C-29（δC 117.8）和C-28（δC 132.2）扩展到咪唑单元。剩余烯质子H-30（δH 7.49）对质子化烯碳C-29和非质子化烯碳C-28的HMBC相关 clearly established the histidine residue。最后，ROESY数据分析揭示了α-次甲基与 preceding residues的酰胺质子之间的五个特征相关。结合分子式，这些数据证明pioamide是一个序列为：同型精氨酸-1、同型精氨酸-2、异亮氨酸、天冬酰胺和组氨酸的环五肽。

BGC of pioamide

P. khanii HGB1456含有27个不同的BGC，可通过基因组登录号WHZZ00000000使用antiSMASH识别。其中，pioamide作为一种环五肽化合物，由非核糖体肽合成酶（NRPS）基因簇合成。Photorhabdus菌株产生在结构上与pioamide相似的抗生素，统称为GameXPeptides，它们是Photorhabdus菌株中常见的次级代谢产物，并表现出广泛的活性。基于此信息，我们调查了负责pioamide的BGC。

在已识别的BGC中，17个是NRPS相关簇。其中一些BGC在一个单一簇中包含多个NRPS基因，表明其有潜力编码多种非核糖体肽。值得注意的是，腺苷化（A）结构域的分析揭示了两个不同的编码五肽的NRPS簇。pioamide的BGC是基于化合物的化学结构和簇的遗传组成推导出来的。这个特定的NRPS基因簇的特点在于存在五个A结构域，其中包含两个相邻的精氨酸残基。这种独特的A结构域配置 strongly implies that the gene cluster region 1.2 is responsible for the production of pioamide。预测的氨基酸序列Arg-Arg-Ile-X-Tyr与观察到的pioamide序列Har-Har-Ile-Asn-His部分一致。α碳的立体化学从模块2、3和4中存在三个双重缩合/差向异构化（C/E）结构域推导出来。双重C/E结构域催化最初结合的L-残基差向异构化为D-构型，然后促进两个残基的缩合。因此，pioamide的立体化学推导为d-Har、d-Har、d-Ile、l-Asn和l-His。

Activity of pioamide

Pioamide对铜绿假单胞菌PAO1表现出选择性活性，MIC相对较高，为128 μg/mL。尽管已报道几种对铜绿假单胞菌有活性的抗菌剂，但只有合成化合物murepavadin表现出对该病原体的选择活性。此外，pioamide对其他细菌物种或人类细胞系无活性。有趣的是，我们发现pioamide对野生型菌株PAO1的MIC与对PΔ6-pore突变株（该突变株缺失六个外排泵（mexAB-oprM、mexCD-oprJ、mexXY、mexJKL、mexEF-oprN和triABC）并在其外膜中产生孔蛋白，使其对多种抗生素高度敏感）的MIC相似。

此外，荧光显微镜分析揭示了用pioamide处理的铜绿假单胞菌细胞的明显形态变化。我们观察到用pioamide处理的铜绿假单胞菌细胞失去了膜完整性。有趣的是，几个细胞经历了多次分裂，从典型的杆状转变为球形，之后它们的生长被抑制。球形细胞的形成通常在用美罗培南（一种抑制细菌细胞壁合成的抗生素）处理的铜绿假单胞菌中观察到。在美罗培南处理下诱导的这些球形细胞显示出有缺陷的细胞壁和外膜，作为一种生存策略。在这种条件下，抗生素的靶点变得不易接近甚至缺失，使得细胞无需获得耐药突变即可存活。我们的结果表明铜绿假单胞菌响应pioamide从杆状转变为球形，使用了与美罗培南处理的铜绿假单胞菌相似的生存机制。这些发现支持了pioamide活性不受外排泵或孔蛋白介导的渗透性显著影响的观点。虽然这可能表明pioamide在不进入细胞的情况下起作用，但也可能它通过特定的摄取途径被吸收，例如先前描述的用于多阳离子抗生素（如多粘菌素和氨基糖苷类）的自我促进摄取机制。此外，铜绿假单胞菌拥有物种特异性的外膜蛋白，如OprD，它促进碳青霉烯类的摄取。其他革兰氏阴性菌，如鲍曼不动杆菌，具有OprD的同源物；然而，删除鲍曼不动杆菌oprD不影响碳青霉烯耐药性。外膜蛋白的这种结构差异可能是pioamide选择性的基础。

为了探索铜绿假单胞菌对pioamide的耐药机制，我们通过将细胞铺在含有四倍MIC pioamide的MHIIA平板上，从铜绿假单胞菌野生型菌株PAO1产生了自发的pioamide抗性突变株。结果，以1.6 × 10^?7–3.7 × 10^?7的频率获得了自发的pioamide抗性突变株。三个突变体的全基因组测序揭示了pmrB中的突变（pmrB L18P、pmrB D47E和pmrB c.450_451ins CAGATCTGGATCAGCGAA），该基因编码双组分调控系统信号传感器激酶。众所周知，pmrB中的特定突变赋予对多粘菌素B和粘菌素的抗性，这些抗生素靶向革兰氏阴性菌中的脂多糖（LPS）并导致细胞裂解。通过添加L-Ara4N修饰脂质A而产生抗性，这降低了脂质A对这些抗生素的亲和力。用粘菌素处理的铜绿假单胞菌的荧光显微镜分析显示立即细胞裂解，当应用琼脂糖垫时在显微镜视野中看不到可见细胞。这一发现表明pmrB突变赋予铜绿假单胞菌对pioamide和粘菌素的抗性，尽管这些抗生素的作用机制不同。最近的一项研究表明，pmrB突变赋予铜绿假单胞菌对粘菌素和murepavadin（POL7080）的交叉抗性。Murepavadin是一种靶向外膜的肽，特异性地与位于细胞表面的LPS转运蛋白LptD相互作用，并通过非裂解机制杀死铜绿假单胞菌。据认为，修饰的LPS导致murepavadin与LptD的结合减少。更可能的是，铜绿假单胞菌对pioamide的抗性是由于pmrB突变抑制了pioamide与其靶标之间的相互作用，如在murepavadin的情况下所观察到的，而不是PmrB本身是靶标。

尽管我们的研究揭示了pioamide活性及其耐药机制的重要见解，但由于目前可用的pioamide数量有限，几个问题仍未得到解答。鉴于耐药机制涉及pmrB，它响应环境压力调节LPS修饰，pioamide的MIC可能因培养介质条件而异。在相关背景下，pioamide的活性是否受二价阳离子（如Ca²⁺和Mg²⁺）的影响仍不清楚，已知这些阳离子会影响革兰氏阴性菌的外膜完整性和抗生素敏感性。因此，在不同离子条件下（例如存在或不存在二价阳离子，或在最小培养基如M9-MOPS中）进行MIC测定可能会提供对pioamide活性的进一步见解。解决这些点的进一步研究将加深我们对pioamide的理解，并有助于开发针对铜绿假单胞菌的新型选择性抗生素。尽管