嗜热四膜虫胱硫醚β-合酶TtCbs1介导CdS量子点生物合成及其在甲基橙光催化脱色中的应用

本研究揭示了嗜热四膜虫（Tetrahymena thermophila）胱硫醚β-合酶（CBS）在镉胁迫响应中的关键作用，通过体外酶催化系统成功合成单分散硫化镉量子点（CdS QDs），并证明其在紫外光照射下对甲基橙具有91%的高效脱色能力，为重金属解毒机制和绿色纳米材料在环境修复中的应用提供了新视角。

　　

引言

生物矿化是生物体中关键的生理过程，微生物通过多种矿化策略在不同生态位中生存与发展。利用活细胞及其分泌物模拟生物矿化合成纳米材料已成为绿色纳米制造的重要策略。硫化镉（CdS）作为一种具有优异光电性能的半导体，在光催化降解有机污染物方面受到广泛关注。传统的CdS合成方法依赖高温高压反应，存在有毒副产物和能源消耗大的问题。而生物合成CdS——利用微生物代谢途径——提供了一种可持续、环保的替代方案，具有巨大的工业潜力。

硫化氢（H₂S）是CdS生物矿化中的关键介质，生物体通过多种代谢途径产生H₂S。在哺乳动物中，胱硫醚β-合酶（CBS）和胱硫醚γ-裂解酶（CSE）从同型半胱氨酸生成H₂S，而3-巯基丙酮酸硫转移酶（3MST）则以3-巯基丙酮酸为底物。细菌还通过亚硫酸盐还原酶将SO₃^2?还原为H₂S。在镉胁迫下，深海细菌Idiomarina sp. OT37-5b产生CdS，半胱氨酸补充增强了细胞CdS的合成。大肠杆菌在镉胁迫下生成CdS量子点（CdS QDs）。深海细菌Pseudomonas stutzeri 273的苏氨酸脱氢酶psTD在体外催化CdS QDs的合成。Stenotrophomonas maltophilia的CSE从半胱氨酸产生H₂S，在Cd²⁺暴露下产生单分散CdS QDs。

原生生物具有丰富的物种多样性和广泛的遗传资源，在生态和生物技术研究中具有巨大价值。嗜热四膜虫（Tetrahymena thermophila）是一种常用于毒理学研究的淡水原生生物，对农药、重金属和纳米材料的毒性高度敏感。这种敏感性，加上其快速繁殖率和易于培养的特点，使其成为研究金属胁迫和其他环境污染物反应的理想模式生物。先前的研究发现，该生物中的半胱氨酸合酶（TtCsa1）是从半胱氨酸产生H₂S的关键酶。除了增强镉耐受性外，TtCsa1介导的体外CdS生物矿化产生了在紫外光下降解亚甲基蓝的光催化纳米材料。为了进一步开发单酶CdS合成，我们研究了嗜热四膜虫在镉胁迫下的转硫途径酶TtCBS1。将His标签的TtCbs1在大肠杆菌中异源表达、纯化，并用于在体外催化单分散CdS QDs的形成。所得生物合成的QDs在紫外照射下表现出快速的甲基橙脱色能力。这项工作推进了原生动物酶在可持续纳米材料合成中的应用，并突出了它们在污染物修复中的潜力。

材料与方法

菌株和试剂

pET28a-sumo-TtCBS1质粒先前在实验室构建。嗜热四膜虫B2086（交配型II）取自康奈尔大学四膜虫库存中心，在30°C的SPP培养基中培养。L-半胱氨酸、氯化镉、还原型谷胱甘肽和硫化钠均使用超纯水制备储备液。

RNA提取和qRT-PCR

对数生长期的嗜热四膜虫细胞暴露于Cd²⁺胁迫（0、12.5、25、50、100和200 μM）12小时。细胞通过离心收获，并使用RNAiso Plus提取总RNA。使用PrimeScript RT试剂盒合成cDNA。实时定量PCR反应系统使用Hieff qPCR SYBR Green Master Mix制备。qRT-PCR程序包括95°C初始变性30秒，随后进行40个循环的95°C变性5秒和60°C延伸30秒。相对表达通过2^?ΔΔCt方法计算，17S rRNA作为内参。所有qRT-PCR实验进行三个生物学重复和三个技术重复。

His-TtCbs1的纯化和体外CdS QDs的生物合成

将pET28a-sumo-TtCBS1质粒转化到大肠杆菌BL21/DE3中。重组菌株在37°C的LB培养基中过夜培养。随后，将过夜培养物转移到500 mL LB培养基中，在37°C培养直至OD₆₀₀达到约0.5。然后加入异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷至终浓度0.05 mM，在16°C诱导重组蛋白表达。大肠杆菌细胞通过超声破碎收获，目标蛋白通过亲和色谱和凝胶过滤色谱纯化。

在Tris-HCl缓冲系统（50 mM，pH 8.5）中，加入半胱氨酸合酶（0.1 mg/mL）、半胱氨酸（4 mM）和镉离子（0.5 mM），在37°C孵育。使用紫外-可见分光光度计分析反应混合物中CdS QDs的紫外-可见吸收光谱。使用荧光分光光度计在350 nm激发波长下测量CdS QDs的荧光发射光谱，激发狭缝宽度为5 nm。在365 nm紫外灯下观察反应系统的光致发光。

反应75分钟后，使用等体积无水乙醇沉淀CdS。混合物以5,000 rpm离心5分钟收集沉淀。沉淀风干并称重以计算CdS的产率。所得CdS溶解在含4 mM半胱氨酸的Tris-HCl缓冲液中，低温避光保存备用。

透射电子显微镜（TEM）

反应75分钟后获得的CdS QDs立即与等体积预冷的20 mM谷胱甘肽在4°C混合。混合物随后在3 kDa浓缩器中离心以减少体积并浓缩。所得悬浮液超声分散并滴加到铜网上，风干后使用透射电子显微镜观察。该技术用于分析纳米颗粒的尺寸、组成和晶体学。X射线能量色散谱（XEDS）分析在15 keV加速电压下进行100秒，以确定CdS QDs的元素组成。

X射线衍射（XRD）

对于XRD分析，将24小时反应的CdS沉淀以8,000 rpm离心30分钟，用无水乙醇洗涤两次，并在37°C烘箱中干燥48小时。收集的沉淀研磨成粉末，并使用X射线衍射仪分析以获得XRD图谱，提供纳米颗粒晶体结构的信息。

扫描电子显微镜（SEM）

块状CdS颗粒使用离子溅射镀膜机镀金5分钟以增强导电性。镀金样品在15 kV加速电压下使用扫描电子显微镜观察颗粒的表面形态。能量色散X射线光谱（EDX）分析在15 kV加速电压下进行100秒，以确认CdS颗粒的元素组成。

CdS纳米颗粒的粒径控制

为证明酶和半胱氨酸控制CdS纳米颗粒粒径的能力，进行了三组实验：单酶法：如前所述进行单酶CdS合成；以半胱氨酸为封端剂的Na₂S法：将半胱氨酸（1 mM）和氯化镉（0.5 mM）加入Tris-HCl缓冲液（50 mM，pH 8.5），随后加入Na₂S（1 mM），在37°C反应；仅Na₂S法：将氯化镉（0.5 mM）加入Tris-HCl缓冲液（50 mM，pH 8.5），随后加入Na₂S（1 mM），在相同反应条件下进行。使用吸光度和荧光光谱以及紫外光直接观察表征溶液中CdS纳米颗粒的光学性质。将每种方法产生的CdS研磨成粉末，并使用傅里叶变换红外（FTIR）光谱仪获得红外光谱。

CdS QDs光催化脱色甲基橙

将CdS QDs加入10 mL溶液中，反应器距离100 W紫外灯（365 nm，160 mW/cm²）10 cm。磁力搅拌器置于反应器下方连续搅拌溶液，同时采用水冷系统维持反应过程中的热平衡。首先，将甲基橙储备液加入混合物中以达到10至70 mg/L的特定浓度。反应系统在室温黑暗中搅拌1小时以确保达到吸附平衡。

随后，在室温下启动光催化反应。定期采集样品，通过离心去除不溶性沉淀。使用可见光分光光度计测量496 nm处的吸光度以计算脱色率。系统研究了催化剂剂量、初始染料浓度和pH对光催化反应的影响。使用0.1 M NaOH和0.1 M H₂SO₄调节反应溶液的初始pH。使用紫外-可见分光光度计测量甲基橙的紫外-可见吸收光谱。脱色率根据模型1计算。对于较低染料浓度，实验数据拟合到一级动力学模型如模型2所述，以观察光催化反应的动力学。这种方法可以全面评估CdS作为光催化剂的性能以及甲基橙脱色中的影响因素。

统计分析

使用IBM SPSS Statistics 27进行单因素方差分析（ANOVA）。事后比较使用Tukey’s HSD（Honestly Significant Difference）检验评估组间是否存在显著差异。统计学显著性用单星号表示P < 0.05，三星号表示P < 0.01。

结果

镉和半胱氨酸上调TtCBS1表达

转硫途径通过中间产物胱硫醚相互转化含硫氨基酸半胱氨酸和同型半胱氨酸。嗜热四膜虫中的转硫途径双向运作。TtCSA1在CdS矿化过程中起关键作用。TtCBS1的敲除导致四膜虫中谷胱甘肽和半胱氨酸水平降低。TtCBS1的基础表达较低，但在镉胁迫下上调，较高Cd浓度（>50 μM）抑制TtCBS1表达，可能是由于氧化应激导致的转录抑制。然而，半胱氨酸补充进一步增强了TtCBS1表达，表明底物可用性放大转硫途径活性的反馈回路。

His-TtCbs1催化体外生物合成CdS纳米颗粒

为分析His-TtCbs1体外合成CdS QDs的酶活性，使用镍亲和色谱和凝胶过滤色谱表达和纯化His-TtCbs1。在含Tris-HCl（50 mM，pH 8.5）、His-TtCbs1（0.1 mg/mL）、半胱氨酸（4 mM）和Cd²⁺（0.5 mM）的反应混合物中，分析紫外-可见吸收光谱和荧光发射光谱。反应0.5小时后，观察到360 nm处的显著紫外吸收峰和485 nm处的荧光发射峰。随着反应时间增加，紫外吸收峰和荧光发射峰均发生红移，表明生成的CdS QDs尺寸增加。紫外照射下，QDs表现出光致发光，展示典型的量子尺寸效应。颜色从蓝色到橙黄色的转变表明颗粒尺寸增加。当反应混合物中省略His-TtCbs1、半胱氨酸或Cd²⁺中的任何一种时，未观察到紫外吸收峰、荧光发射峰或可见光致发光。

合成的CdS QDs单分散且结晶

TEM观察显示反应系统产生均匀分布的QDs，呈现典型晶格条纹。XEDS分析确认生成颗粒中存在硫和镉元素。SAED图谱表明形成单晶CdS QDs。HAADF成像显示QDs均匀分布，平均颗粒尺寸为3.51 nm。

当反应时间延长至48小时，SEM观察和EDS分析确认形成块状CdS。FTIR显示1,520 cm?1和1,640 cm?1处的峰，分别代表酰胺II和酰胺I键。这表明生成的CdS与蛋白质之间存在相互作用。XRD图谱显示28.18°和47.96°处的衍射峰，对应CdS的（111）和（220）晶面（JCPDS no. 21-0829）。

半胱氨酸和谷胱甘肽增强CdS QDs稳定性

在通过单酶系统生成QDs的过程中，硫醇起关键作用，不仅促进QDs形成，还维持其颗粒尺寸稳定性。半胱氨酸作为硫醇化合物，是His-TtCbs1产生H₂S的底物。为研究半胱氨酸的额外作用，我们在反应中加入4、10和20 mM半胱氨酸作为底物。0.25小时后，观察到329、361和372 nm处的紫外吸收峰，显示浓度依赖性增加。紫外光下的光致发光显示QDs分别发出蓝、绿和黄光，表明半胱氨酸浓度增加增强了QDs的生成。随着反应时间延长，紫外吸收峰逐渐增强，CdS QDs转变为更大颗粒尺寸。反应12小时后，以4和10 mM半胱氨酸为底物的系统出现CdS聚集，而以20 mM半胱氨酸为底物的系统保持CdS QDs的稳定性。这表明半胱氨酸除作为H₂S生产的底物外，还作为封端剂增强CdS QDs的稳定性。

谷胱甘肽是另一种硫醇化合物，常在QDs合成中作为封端剂。使用4 mM半胱氨酸作为底物，我们通过添加0、1、5和10 mM浓度研究谷胱甘肽的功能作用。添加谷胱甘肽导致紫外吸收峰剂量依赖性降低。值得注意的是，5和10 mM谷胱甘肽即使在12小时后仍促进CdS QDs的稳定性。进一步研究发现，添加谷胱甘肽不影响半胱氨酸消耗速率。此外，谷胱甘肽不作为酶催化生成QDs的底物。因此，添加谷胱甘肽后紫外吸收峰的降低可归因于其作为封端剂的作用。

CdS QDs脱色甲基橙

为分析生物合成CdS QDs的光催化活性，评估了甲基橙的脱色效率。CdS QDs对甲基橙的脱色呈浓度依赖性。具体而言，7.5 mg CdS QDs在3小时内有效脱色90%的20 mg/L甲基橙溶液。催化动力学曲线表明7.5 mg CdS QDs比其他浓度表现出更高的催化速率。

为阐明光催化脱色过程中甲基橙的分子特性，监测了其紫外-可见吸收光谱的变化。初始464 nm处的吸收峰随着光催化反应进行显著降低，伴随颜色从橙色变为无色。在特定CdS QDs浓度（7.5 mg）下，分析了不同初始浓度（10、20、40、55和70 mg/L）甲基橙的脱色效率。脱色率在10 mg/L时最高，而随着染料浓度增加，脱色率逐渐降低。k_app值从0.7296 min?1降至0.2297 min?1随着浓度增加。甲基橙的颜色变化表明脱色时间内颜色逐渐变浅。此外，酸性环境中脱色率更高。

讨论

H₂S是多种生物镉解毒的关键参与者。在植物中，H₂S在响应Cd²⁺胁迫时迅速激活，先于半胱氨酸积累。这种早期反应强调了H₂S作为启动应激适应主要信号的作用。在Pseudomonas stutzeri 273中，苏氨酸脱氢酶敲除减少了H₂S产生，损害了Cd去除效率。相反，在大肠杆菌中过表达半胱氨酸脱硫酶增强了CdS矿化。我们先前的工作表明，参与从头半胱氨酸合成的半胱氨酸合酶TtCsa1对嗜热四膜虫中的CdS生物矿化至关重要。本研究中，我们观察到镉胁迫下TtCBS1的显著上调在25 μM Cd时达到峰值。Cd浓度进一步增加（>50 μM）导致TtCBS1表达下降，表明氧化应激介导的代谢抑制。然而，补充半胱氨酸进一步上调了TtCBS1表达，表明半胱氨酸可能有效缓解镉毒性。

重组CSE单酶系统利用半胱氨酸生成H₂S。在高pH值下，H₂S解离成HS?，为CdS QDs合成提供必需硫源。随后，HS?与Cd²⁺反应形成CdS QDs。反应时间和封端剂的选择显著影响CdS的颗粒尺寸。本研究中，我们观察到His-TtCbs1催化的CdS QDs随着反应时间增加，紫外吸收和荧光发射峰均发生红移。这表明颗粒尺寸持续增大。紫外光下，光致发光从代表较小颗粒的蓝色转变为与较大颗粒相关的黄色。半胱氨酸和谷胱甘肽均作为有效封端剂，稳定CdS的QD形式。利用His-TtCbs1进行CdS QDs合成的单酶系统通过反应时间和封端剂选择展现出对颗粒尺寸的显著可控性。该系统生产具有可调特性的稳定CdS QDs的能力突出了其在绿色合成应用中的潜力，为传统化学方法提供了可持续替代方案。

CdS是一种广泛研究的半导体材料，以其独特的光电性能而闻名，使其成为光催化应用的有前途候选者。通过降解紫外光下的甲基橙评估了生物合成CdS QDs的光催化性能。CdS QDs在3小时内实现了20 mg/L甲基橙溶液的90%脱色。脱色率随着染料浓度增加而降低。较高浓度的甲基橙阻碍光穿透，减少了暴露于紫外光的CdS QDs有效表面积，从而降低了催化效率。观察到的浓度依赖性效率突出了在实际应用中优化反应条件的重要性。

CdS QDs的脱色率在酸性和碱性条件下均显著高于中性pH。在酸性条件下，CdS QD表面质子化，增强阴离子甲基橙染料分子的吸附。这种改进的吸附促进了染料和光催化剂之间的更近距离，从而增加了反应物种相互作用的可能性。在碱性介质中，CdS表面氢氧根离子（OH?）积累增加。吸附位点处OH?离子的存在增强了·HO的生成，这些高反应性物质促进了光催化过程。紫外光照射下，CdS QDs中的电子被激发并跃迁到导带，产生光电子（e^?）。这些光生电子将O₂还原形成超氧阴离子（·O₂^?）。位于CdS价带中的空穴（h⁺）与氢氧根离子（OH^?）反应生成羟基自由基（·OH），这些在光化学反应中对有机染料的脱色至关重要。羟基自由基和超氧阴离子等反应物种的生成高度依赖于pH条件，进而影响整体光催化活性。理解这些pH依赖性机制对于优化CdS QDs在实际应用中的光催化性能至关重要。

传统上，甲基橙的脱色严重依赖通过化学方法合成的纳米材料，这些方法通常需要高温、高压和使用有机试剂等严格条件。将CdS与先前报道的去除甲基橙的光催化剂进行比较。结果表明，通过酶介导过程合成的CdS表现出与文献报道的催化剂相当的催化效率，突出了本研究中开发的催化剂的优异光催化脱色能力。我们的研究利用His-TtCbs1单酶系统在室温下合成CdS QDs，为传统化学方法提供了绿色可持续的替代方案。生物合成的CdS QDs在120分钟内实现91%的甲基橙脱色率，与化学合成材料相当。然而，本研究中合成的CdS QDs在可见光下不能有效降解染料分子，限制了它们在更广泛环境场景中的适用性。虽然当前的CdS QDs在可见光活性方面有限，但未来对材料组合和界面工程的研究有望增强其在更广泛环境修复场景中的适用性。

结论

总之，本研究证实了TtCBS1参与嗜热四膜虫对镉胁迫的响应。单酶系统促进了体外单分散CdS QDs的生成，半胱氨酸既作为底物又作为封端剂。这一进展证明在紫外光下有效降解甲基橙。这项研究进一步扩展了单酶系统作为合成QDs的新颖有效方法的范围，展示了它们在光催化染料脱色领域中的应用前景。

致谢

我们感谢实验菌平台张飞燕女士对HRTEM测试的支持。这项工作得到了国家自然科学基金、山西省重点研发计划国际科技合作项目和山西省留学回国人员科技活动择优资助项目的支持。