由真菌衍生的信号分子α-萜品烯诱导的溶杆菌（Lysobacter）产酶基因对真菌的耐药机制

《Applied and Environmental Microbiology》：Mechanism of Lysobacter enzymogenes resistance toward fungi induced by fungal-derived signal α-terpinene

α-terpinene通过LeCzcS/LeCzcR双组分系统调控环境细菌L. enzymogenes YC36的抗真菌活性（HSAF、GluB）和生物膜形成，增强其与真菌的竞争能力。

　　细菌与真菌之间的相互作用（BFI）是生态系统功能的重要驱动力，然而其分子机制仍不完全明确。化学信号在微生物交流中起着关键作用，但由真菌分泌的萜烯化合物的信号机制尚未被充分阐明。本研究利用环境细菌*Lysobacter enzymogenes* YC36（简称*Le*YC36）系统地探讨了由真菌产生的α-萜品烯对生物膜形成和抗真菌活性的调控机制。研究结果表明，α-萜品烯通过促进抗真菌效应物、热稳定抗真菌因子（HSAF）以及真菌细胞壁水解酶GluB的生物合成，增强了*Le*YC36在BFI中的竞争力，同时提升了生物膜的形成能力。此外，我们揭示了*Le*YC36中由α-萜品烯介导的信号通路。*Le*YC36通过其两个组分系统*Le*CzcS/*Le*CzcR中的传感器组氨酸激酶*Le*CzcS检测真菌信号α-萜品烯，然后将信息传递给调节因子*Le*CzcR。被磷酸化的*Le*CzcR直接刺激下游功能基因*Lepks/nrps_HSAF*（*Lehsaf*）、*LegluB*和*Lepsl*的表达，从而增强抗真菌效应物（HSAF和GluB）的产生，改善生物膜形成，并最终提升*Le*YC36对真菌的竞争力。本研究阐明了α-萜品烯在BFI中的作用及其调控机制，为微生物之间的通信和合作适应提供了新的视角。

研究的重要性在于，细菌与真菌之间的复杂相互作用对于维持生态系统的平衡和生物多样性具有关键作用。本研究揭示了α-萜品烯作为真菌来源的信号分子如何调控*Le*YC36的生物膜形成和抗真菌活性，并初步建立了α-萜品烯的信号调控通路。这些发现加深了我们对细菌与真菌之间跨界信号的理解，并为利用微生物信号分子开发生物防治技术提供了理论基础。

在自然界中，细菌和真菌是生态系统的重要组成部分，广泛分布于土壤、宿主相关环境等多样的生态系统中，形成动态且不断进化的微生物群落。细菌与真菌的相互作用不仅作为生态系统功能的关键驱动力，还在维持生物多样性和生态平衡中发挥着重要作用。这些相互作用可能具有对抗性或协同性，受到共同栖息地、化学信号、分子调控和基因交换等多种因素的影响。这种相互作用影响着营养竞争、合作行为和生态位适应，最终塑造微生物群落并建立对生态系统稳定至关重要的功能网络。关于微生物化学信号转导的研究主要集中在细菌分泌的化合物对其他细菌或真菌的影响上，而真菌分泌的化合物对细菌生理的影响则研究较少。近年来的研究表明，真菌可以产生超过300种挥发性有机化合物，包括萜烯、醇类、苯甲酸类、醛类、烯烃、酸类、酯类和酮类等多种化学物质。α-萜品烯是一种天然的单萜烯化合物，广泛存在于植物和一些真菌中，通常作为次生代谢产物释放到环境中。已有研究表明，α-萜品烯作为一种跨界的信号分子，可以调节细菌的生理活动，并在真菌与细菌的相互作用中发挥重要作用。然而，α-萜品烯如何诱导细菌与真菌之间的竞争或合作的具体机制仍不清楚。需要进一步研究以探讨细菌对α-萜品烯的响应策略。深入了解这些过程有助于全面评估生物多样性和生态平衡在自然环境中的作用。

*Lysobacter enzymogenes*因其对抗真菌和革兰氏阳性菌的显著能力而成为一种有前景的生物防治剂。与其他环境细菌不同，*L. enzymogenes*以其独特的生态适应性和多样化的抗菌机制而著称，包括分泌胞外酶和次生代谢产物，从而表现出强大的抗菌活性。其中，热稳定抗真菌因子（HSAF）因其强大的抗真菌活性和新颖的作用方式而受到广泛关注。然而，关于*Le*YC36如何响应真菌来源的信号的信息仍然有限。理解*Le*YC36与真菌相互作用的机制和调控通路至关重要。这些见解对于阐明*Le*YC36对抗真菌病原体的“进攻”与“防御”双重策略具有重要意义。本研究从进攻和防御的角度出发，探讨了由真菌产生的信号分子α-萜品烯对*Le*YC36的抗真菌效应物和生物膜形成的调控作用，并阐明了*Le*YC36对α-萜品烯的响应和调控机制。这将为揭示微生物通信和竞争的新方面提供理论基础。

实验结果表明，α-萜品烯增强了*Le*YC36的抗真菌活性。在*Le*YC36与真菌的相互作用中，我们发现α-萜品烯能够显著抑制*Aspergillus niger*和*Penicillium* sp.的生存率（CFU检测）。我们向*Le*YC36与真菌的共培养体系中加入α-萜品烯，并发现实验组（真菌 + *Le*YC36 + α-萜品烯）的真菌存活率明显下降。为了确定这一现象是否由α-萜品烯对真菌或细菌的生长能力的影响引起，我们分别监测了*Le*YC36和真菌在α-萜品烯条件下的生长曲线。实验结果显示，α-萜品烯并未影响*Le*YC36的生长能力。如图1A和C所示，在没有*Le*YC36的情况下，α-萜品烯对*A. niger*和*Penicillium* sp.的存活率和生长能力没有显著抑制作用。这表明，α-萜品烯并非通过促进细菌生长或抑制真菌生长来增强细菌的竞争力，而是通过更复杂的调控机制提高*Le*YC36的抗真菌能力。已知*L. enzymogenes*会产生胞外酶和抗真菌因子来抑制真菌生长。因此，我们提取了在有或无α-萜品烯条件下*Le*YC36的发酵上清液，并评估其对真菌生长的抑制效果。实验结果表明，向*Le*YC36发酵上清液中添加α-萜品烯并未改变其对真菌的抑制区域直径。然而，当α-萜品烯在*Le*YC36的发酵过程中被添加时，所得发酵上清液表现出更强的抗真菌效果，如图1F和G所示，其抑制区域明显大于对照组。这表明，α-萜品烯可能通过诱导*Le*YC36产生更多的抗真菌物质来增强其抗真菌能力。

进一步的研究显示，α-萜品烯能够促进*LegluB*和*Lehsaf*基因的表达，从而改善*Le*YC36的竞争力。比较转录组分析表明，在α-萜品烯的诱导下，*Le*YC36中*LegluB*基因的表达显著上调。GluB是一种β-1,3-葡聚糖酶，能够水解真菌细胞壁，与*L. enzymogenes*的抗真菌能力密切相关。通过定量PCR（qPCR）验证了α-萜品烯诱导下*LegluB*基因表达水平的增加。我们使用的*Le*Δ*gluB*菌株是由本实验室提供的。结果显示，当在α-萜品烯诱导下，突变株*Le*Δ*gluB*的抑制区域与对照组相比没有显著差异，且α-萜品烯无法再促进突变株的抗真菌能力。这表明，*LegluB*基因在α-萜品烯调控*Le*YC36抗真菌活性的信号通路中起着关键作用。除了胞外酶外，*L. enzymogenes*还产生多种具有抗真菌活性的次生代谢产物，其中HSAF在抗真菌活性中起主导作用。在α-萜品烯条件下，我们测量了*Le*YC36中*Lehsaf*基因的表达水平，该基因编码一种混合的PKS-NRPS酶，是HSAF合成的关键基因。如图2F和G所示，α-萜品烯显著上调了*Lehsaf*基因的表达和HSAF的产量。在删除*Lehsaf*基因后，突变株无法产生HSAF，失去了其抗真菌活性，并且不再对α-萜品烯的调控产生反应。这表明，HSAF的产生是*L. enzymogenes*在响应α-萜品烯时增强其抗真菌能力的关键前提。上述实验结果证实了α-萜品烯显著增强了*Le*YC36的抗真菌能力。推测当*Le*YC36检测到环境中的真菌信号分子α-萜品烯后，它识别出竞争的真菌物种，从而触发抗真菌效应物的表达增加，以维持其竞争优势。

我们还研究了α-萜品烯对*Le*YC36生物膜形成的影响。如果将HSAF和GluB视为*L. enzymogenes*的“进攻武器”，那么生物膜则在与真菌的相互作用中充当“防御屏障”。生物膜可以抵抗真菌毒素、代谢废物和其他有害物质，为细菌提供相对稳定的微环境。生物膜在细菌与真菌的相互作用中起着关键作用，因为其形成会导致细菌毒力因子的积累，最终导致真菌细胞的死亡。因此，我们检查了α-萜品烯是否影响*Le*YC36的生物膜表达。结果表明，在0.1 μM α-萜品烯的诱导下，*Le*YC36的生物膜形成显著增加。这表明，α-萜品烯对*Le*YC36竞争力的促进作用是多维的。比较转录组分析显示，α-萜品烯上调了*Le*YC36中胞外多糖合成基因（*LepslA*、*LepslD*和*LepslE*）的表达。目前，*L. enzymogenes*的主要胞外多糖成分尚未明确。分析结果揭示了*Le*YC36中的胞外多糖合成簇与*Pseudomonas aeruginosa*的*psl*簇之间存在部分保守性。四个与*psl*同源的基因被指定为*LepslA*、*LepslD*、*LepslE*和*LepslI*。我们首先确定这三个基因（*LepslA*、*LepslD*和*LepslE*）是否参与*Le*YC36的生物膜合成。我们删除了*pslE*基因以获得突变株*Le*Δ*pslE*。所使用的*Le*Δ*pslA*和*Le*Δ*pslD*突变株是由本实验室提供的。结果显示，三个突变株的生物膜形成受到抑制，且α-萜品烯对生物膜形成的促进作用消失。这表明，*LepslA*、*LepslD*和*LepslE*是*Le*YC36生物膜形成的关键因素。qPCR结果与比较转录组结果一致，表明这三个基因的表达在α-萜品烯条件下显著上调，表明α-萜品烯可能通过调控生物膜合成基因的表达来促进生物膜的形成。

为了进一步研究*Le*YC36如何识别和响应α-萜品烯信号，我们探讨了其信号通路。细菌通过两个组分系统（TCSs）来感知外部信号并响应环境变化，这些系统包括传感器激酶和响应调节因子。转录组分析显示，α-萜品烯显著上调了两个调节因子*Le*CzcR和*Le*DesR的表达。对这两个TCSs的基因表达分析确认了转录组的结果。我们随后删除了这两个TCSs的基因，并对突变株进行了生物膜形成实验和抗真菌实验。结果显示，在突变株*Le*Δ*czcS*中，α-萜品烯诱导的抗真菌活性和生物膜形成均消失。然而，在缺乏基因*Le*DesK的情况下，α-萜品烯仍能诱导这两个生理现象的增加。生长曲线实验表明，删除*Le*CzcS或*Le*CzcR基因并未影响*Le*YC36的生长能力，这表明观察到的生理现象并非由生长抑制引起。同时，生物层干涉技术（BLI）显示，*Le*CzcS（见图S1）在体外与α-萜品烯呈浓度依赖性结合，而*Le*DesK则未检测到这种结合。这些结果表明，*Le*CzcS参与了α-萜品烯的识别，并且*Le*CzcS/*Le*CzcR系统在*Le*YC36的α-萜品烯信号通路中起着关键作用。生理实验表明，在*Le*Δ*czcR*突变株中，α-萜品烯诱导的生物膜形成被抑制（见图4G），且抗真菌活性同样受到影响（见图4H至J）。qPCR结果与生理观察结果一致，显示突变株在α-萜品烯条件下的生物膜和抗真菌效应物合成基因表达水平未发生变化。这表明，*Le*CzcR在调控α-萜品烯信号通路中的下游基因表达方面起着重要作用。通过上述实验，我们确认了α-萜品烯显著增强了*Le*YC36的抗真菌能力。推测当*Le*YC36检测到环境中的真菌信号分子α-萜品烯后，它识别出竞争的真菌物种，并触发抗真菌效应物的表达增加，以维持其竞争优势。

在进一步研究中，我们发现*Le*CzcS/*Le*CzcR系统在识别α-萜品烯信号和调控下游基因表达中起着核心作用。然而，其分子作用机制与*P. aeruginosa*中的CzcS/CzcR系统存在显著差异。CzcS/CzcR系统主要调控*P. aeruginosa*中的锌稳态、群体感应和抗生素耐受性，而我们的研究则表明，该系统在*L. enzymogenes*中进化出一种新的功能，即化学信号的识别。尽管如此，*Le*CzcS对α-萜品烯识别的结构决定因素仍有待阐明。进一步研究*Le*CzcS的周质结构域与α-萜品烯的具体相互作用机制将有助于我们更深入地理解微生物跨界的信号转导网络。值得注意的是，真菌中α-萜品烯的生物合成途径尚未被明确。为了探讨其功能作用，我们将*L. enzymogenes*的野生型和TCS缺失突变株与α-萜品烯产生菌*F. culmorum*共培养（见图5L）。结果进一步证实了真菌来源的α-萜品烯识别增强了*Le*YC36的抗真菌活性。未来的研究应采用靶向基因敲除的方法，以阐明α-萜品烯在*Lysobacter*与真菌相互作用中的完整调控作用。

本研究还详细描述了实验材料和方法。实验中使用的细菌和真菌菌株包括*A. niger* ATCC 1640、*Penicillium* sp.和*F. culmorum* CGMCC 3.4283，它们在28°C的马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基中培养。*Le*YC36及其突变株在28°C的40%胰蛋白酶大豆肉汤（TSB）培养基中培养。*Escherichia coli* DH5α、BL21 (DE3)和S17-1 λpir菌株被用于DNA操作。所有分子操作均按照既定方法进行。所使用的菌株和质粒列于表S1中。分子生物学和生物化学所需的试剂由Takara（日本）和Yeasen（中国）公司提供。PCR引物由Sangon Biotech（中国）和北京清科公司合成，并由这些公司提供测序服务。除非另有说明，实验中使用的α-萜品烯浓度为0.1 μM，溶剂为二甲基亚砜（DMSO）。在对照组中，DMSO的体积与实验组中α-萜品烯的体积相同。

为了检测信号分子对生物膜形成的影响，*Le*YC36在含有0.1 μM α-萜品烯（实验组）或不含α-萜品烯（对照组）的40% TSB培养基中培养，直至达到对数生长期。在达到对数生长期前30分钟，实验组被补充至0.1 μM的α-萜品烯，并继续培养至对数生长期。收集细菌，使用细菌RNA试剂盒（Yeasen，中国）按照制造商的说明提取RNA。测量RNA浓度时使用微分光谱仪（Thermo Fisher Scientific，美国），并将RNA逆转录成cDNA，使用逆转录试剂盒（ABM，加拿大），然后储存于-20°C。实时PCR在20 μL的总反应体积中进行，使用Hieff qPCR SYBR Green Master Mix（Yeasen，中国）和StepOne实时PCR系统（Applied Biosystems，美国），以16S rRNA作为参考基因。所有实验均来自三个生物学重复。

转录组分析用于研究*Le*YC36在0.1 μM α-萜品烯处理和未处理条件下的转录组。实验步骤如“基因转录检测”部分所述。测量RNA浓度后，使用Illumina HiSeq平台进行测序。在原始测序数据的质量控制后，获得高质量、干净的数据。随后，将这些干净的读数对*Le*YC36参考基因组进行比对，生成映射数据。根据log2（Fold Change）>0和P值<0.05的标准，定义显著上调的基因。这些基因使用京都基因与基因组百科全书（KEGG）数据库进行注释，以预测其功能和相关的代谢途径。

为了进行异源表达和纯化，使用*Le*YC36基因组作为模板，扩增*LeczcR*的DNA序列，并将其连接到pET-28a (+)表达载体中。重组质粒被转入*E. coli* BL21 (DE3)进行蛋白表达。培养后的菌株被收集，并使用超声波细胞破碎仪（JY92-IIN，Scientz，中国）在三次（35%功率，10分钟）中破碎。破碎后的菌株在4°C（12,000 rpm，10分钟）离心后，上清液被过滤通过0.22 μm膜，并使用含有0.1%乙酸的水（溶剂A）和含0.1%乙酸的乙腈（溶剂B）进行高分辨率液相色谱（HPLC）分析。流速为1 mL/min，检测波长为320 nm。梯度（30分钟总时间）：20%溶剂B（0分钟），到35%（5分钟），到75%（12分钟），到90%（20分钟），到100%（27分钟）。蛋白纯化通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）验证，并使用商业试剂盒测定蛋白浓度。

为了研究*Le*CzcS与α-萜品烯的体外结合，我们使用生物层干涉技术（BLI）进行分析。膜蛋白*Le*CzcS和*Le*DesK的纯化按照既定方法进行，使用的异源表达载体为pET-19b。纯化的膜蛋白在PBST（PBS + 0.02% Tween-20）中进行透析，并加载到Ni-NTA生物传感器（Sartorius，德国）上。使用Octet R8系统（Sartorius，德国）对α-萜品烯（1、10、20 μM）的浓度依赖性结合进行定量分析。膜蛋白*Le*DesK也作为对照加载到生物传感器上。

为了检测*Le*CzcS与α-萜品烯的结合，我们进行了电泳迁移率变化实验（EMSA）。基于Liu等人（参考文献48）的方法，并进行了部分修改。*Le*CzcR的纯化按照上述方法进行。使用Promoter Prediction工具（BDGP：神经网络预测）预测启动子序列，并设计特异性引物。以*Le*YC36基因组为模板，扩增启动子区域的DNA片段。片段使用凝胶/PCR纯化试剂盒纯化，并稀释至最终浓度为50 ng/μL。EMSA反应体系（10 μL）包含20 ng的生物素化DNA、20 ng的未标记DNA作为竞争者、40 ng的*Le*YC36基因组无关DNA作为对照、30 mM乙酰磷酸（ACP）、2.4 μg的*Le*CzcR_D51A作为蛋白对照以及不同浓度的*Le*CzcR。反应混合物在25°C下孵育30分钟，并使用6%的天然聚丙烯酰胺凝胶在恒定电压110 V下电泳90分钟。随后，将化合物转移到尼龙膜（Millipore，美国）上，电流为350 mA，持续90分钟。使用链霉亲和素-过氧化物酶偶联物监测生物素化探针的迁移。

统计分析方面，我们使用学生t检验进行两组之间的比较，使用单因素方差分析（ANOVA）进行多组之间的比较。数据以平均值±标准差（n=3生物学重复）的形式呈现。

本研究通过一系列实验，揭示了α-萜品烯在细菌与真菌相互作用中的关键作用及其调控机制。α-萜品烯通过激活*Le*CzcS/*Le*CzcR系统，调控下游抗真菌效应物和生物膜合成基因的表达，从而提升*Le*YC36的抗真菌能力。这些发现不仅加深了我们对微生物之间通信机制的理解，也为开发基于微生物信号分子的生物防治技术提供了理论支持。此外，研究还表明，生物膜的形成在*Le*YC36的抗真菌策略中同样发挥着重要作用，有助于其在植物根际环境中的定殖，形成排斥区，防止病原真菌的入侵和感染。这些结果为理解生物防治细菌的生态适应性提供了新的视角，并为进一步应用*Le*YC36对抗病原真菌奠定了基础。