利用钮扣树四种酶实现酵母从头生物合成螺环氧化吲哚生物碱

为解决螺环氧化吲哚生物碱（spirooxindole alkaloids）依赖植物提取、合成困难的问题，研究人员开展了基于钮扣树（Cephalanthus occidentalis）酶资源的生物合成研究，成功鉴定并表征了CoAJS、CoHYC3O、CoHYC3R和CoOIS四种酶，在酵母中实现了mitraphylline和uncarine F等活性分子的从头合成，为天然药物生物制造提供了新策略。

　　

在天然产物研究领域，单萜吲哚生物碱（Monoterpenoid Indole Alkaloids, MIAs）因其复杂的化学结构和显著的药理活性一直备受关注。其中，螺环氧化吲哚（spirooxindole）类生物碱更是一颗耀眼的明星——它们不仅拥有独特的螺旋环系结构，还展现出神经保护、抗癌、镇痛等多重生物活性。例如来自猫爪藤（Uncaria rhynchophylla）的钩藤碱（rhynchophylline）能改善脑缺血症状，而来自卡痛树（Mitragyna speciosa）的帽蕊木碱（mitraphylline）则具有抑制肿瘤生长的潜力。然而，这类化合物的获取长期以来依赖植物提取，产量低、成本高，且立体异构体繁多难以分离，严重制约了其研究和应用。更关键的是，它们的生物合成途径至今仍笼罩在迷雾之中。

为什么这些活性分子难以通过化学合成？又能否通过合成生物学手段实现微生物工厂化生产？这些问题的答案，藏在植物酶催化机制的奥秘里。以往研究表明，绝大多数MIAs源于 Strictosidine（strictosidine）这一共同前体，其C3位的手性中心（3^S构型）通过一系列酶促反应最终决定了产物的立体结构。2016年，科学家发现 strictosidine 合成酶（STR）专一性地催化生成3^S构型产物，而近年鉴定的C3-氧化酶（HYC3O）和C3-还原酶（HYC3R）组合则能巧妙地将构型翻转为3^R，为氧化吲哚类生物碱的生成提供了可能。2023年，Nguyen等人从卡痛树中发现了第一个氧化吲哚合成酶Ms3eCIS，但它仅作用于3^R-corynanthe型底物，且机制尚未完全阐明。那么，其他类型氧化吲哚（如异胡薄荷碱型）是如何合成的？其酶系统是否具有更广泛的底物适应性？这些谜题等待被解开。

正是在这样的背景下，加拿大新不伦瑞克大学的研究团队将目光投向了北美原生的茜草科植物——钮扣树（Cephalanthus occidentalis）。通过转录组挖掘、酶功能表征和酵母合成生物学平台构建，他们成功解析了该植物中氧化吲哚生物碱的完整生物合成途径，相关成果发表在《BioDesign Research》上。

本研究主要采用了以下关键技术方法：基于Illumina NovaSeq平台的钮扣树叶转录组测序和Trinity从头组装；LC-MS/MS（液相色谱-串联质谱）与NMR（核磁共振）用于化合物鉴定；多基因酵母表达系统（使用pESC系列载体）进行异源重构；体外酶动力学分析采用酵母微粒体蛋白孵育体系；底物谱评估通过喂养实验完成；进化树构建使用MEGA11软件。

研究结果部分通过层层递进的实验设计揭示了完整通路：

C. occidentalis 积累 ajmalicine 3-差向异构体和 mitraphylline 7-差向异构体

通过酸碱提取和制备薄层色谱，从钮扣树叶中分离鉴定出五种主要生物碱：strictosidine、ajmalicine、3-epi-ajmalicine、mitraphylline 和 isomitraphylline（7-epi-mitraphylline）。NMR结构解析证实了3位和7位立体化学的差异，提示植物体内存在活跃的C3差向异构化和氧化吲哚生成活性。

通过三酶途径在酵母中从头生产 3-epi-ajmalicine

表达钮扣树来源的ajmalicine合酶（CoAJS）能催化生成ajmalicine、mayumbine和tetrahydroalstonine；叠加CoHYC3O后产生3-dehydro-ajmalicine；进一步引入CoHYC3R则成功获得3-epi-ajmalicine，证实了C3构型翻转酶系的功能。

C. occidentalis 氧化吲哚合酶将 3^R-异胡薄荷碱多样化为多种氧化吲哚差向异构体

新鉴定的细胞色素P450酶CoOIS（与Ms3eCIS有75%同源性）能将3-epi-ajmalicine转化为mitraphylline/isomitraphylline混合物和3-dehydro-ajmalicine；以akuammigine（3-epi-tetrahydroalstonine）为底物时，则生成包括pteropodine和uncarine F在内的四个差向异构体。底物谱测试显示CoOIS专一作用于3^R-异胡薄荷碱类，而Ms3eCIS还能氧化3^R-yohimbine类底物。酶动力学分析表明CoOIS对3-epi-ajmalicine和akuammigine的催化效率（V_max/K_M）相近，但亲和力（K_M值）和转换数（V_max）存在差异。

从头生产异胡薄荷碱氧化吲哚

在能生产3-epi-ajmalicine的酵母菌株中共表达CoOIS和CrCPR（Catharanthus roseus细胞色素P450还原酶），成功获得mitraphylline/epi-miraphylline（产量2.93 μg/L）；而改用C. roseus来源的HYC3O/HYC3R组合则导向akuammigine合成途径，经CoOIS催化产生主要产物uncarine F（2.35 μg/L）。

在讨论部分，作者指出氧化吲哚合酶可能仅在茜草科中特异进化（在夹竹桃科中未发现同源物），CoOIS与Ms3eCIS虽同源但底物偏好不同：前者专一于异胡薄荷碱骨架，后者能作用于多类3^R-生物碱。酵母从头合成证明 pathway 重构的可行性，但当前产量仍较低，主要瓶颈在于HYC3O的活性不足（其依赖糖基化修饰）和3-dehydro中间体胞外积累导致的通量损失。建议通过信号肽工程（如采用酵母CPY信号肽）和酶分子改造提升效率。

该研究首次报道了钮扣树中氧化吲哚生物碱的完整四酶合成途径，揭示了CoOIS的底物杂泛性特征，为微生物工厂化生产高价值氧化吲哚药物提供了关键酶元件和理论依据。这不仅深化了对植物天然产物多样性的认知，也为合成生物学驱动的新型药物研发奠定了坚实基础。