利用碱性细菌加速石灰砂浆碳化：从菌株筛选到碳化动力学机制研究

本综述系统探讨了利用碱性细菌（如Shouchella clausii和S. patagoniensis）加速石灰砂浆碳化的创新策略。研究通过适应性实验室进化（ALE）获得高pH耐受菌株，结合热重分析（TGA）、气相色谱（GC）和流式细胞术等多维度技术，揭示了细菌代谢产生的CO2可显著提升碳化速率，并首次观察到李泽冈环（Liesegang patterns）现象。尽管细菌直接混合会短期抑制碳化，但为克服传统石灰硬化慢、兼容性差等瓶颈提供了微生物解决方案（MICP），对历史建筑修复和绿色建材开发具有重要价值。

　　

引言

波特兰水泥在过去一个世纪因其快速硬化的特性逐渐取代了水硬性石灰，但水泥在历史建筑修复中存在兼容性问题。石灰砂浆因其较高的孔隙率和湿度传导性，更能有效减少砖石结构的湿度或盐损伤，但其缓慢的碳化过程（硬化速度慢）限制了广泛应用。石灰的硬化过程依赖于氢氧化钙与CO₂的反应，涉及CO₂溶解为碳酸（H₂CO₃）、电离为碳酸氢根（HCO₃^-）和碳酸根（CO₃^2-），最终与钙离子结合形成碳酸钙（CaCO₃）。CO₂在孔隙系统中的扩散性是主要速率限制步骤，受孔隙大小分布和含水量影响。在理想条件下，石灰的CO₂吸收速率可达每毫摩尔石灰每秒吸收2.84×10^?3 mmol CO₂，但自然环境下碳化过程可能长达数千年。

为提高碳化速率，可调控温度、湿度（40%–80%最佳）和CO₂浓度（最高20%）。增加CO₂浓度是最有效策略，但过高会导致CaCO₃不透水层形成，反而抑制碳化。现有加速石灰硬化的方法多依赖昂贵或有毒化学品，而微生物介导的碳化（Microbially Induced Carbonate Precipitation, MICP）因其产生CO₂和胞外聚合物（EPS）控制矿化动力学，成为有前景的替代方案。细菌添加剂在水泥中已有应用，但石灰的高pH（>12）和小孔隙环境对细菌生存构成挑战，需选择耐碱菌株或采用保护机制。

本研究从石灰砂浆墙体中分离耐碱细菌，通过适应性进化提升其高pH耐受性，评估其CO₂生产能力、碳化石灰砂浆的能力，以及直接掺入石灰后的影响，旨在为石灰基材料的早期硬化提供微生物解决方案。

材料与方法

环境分离活动：从比利时根特的一处石灰砂浆墙体取样，通过X射线衍射（XRD）分析确认矿物组成（方解石和石英）。样品经HCl处理收集酸不溶残留物，使用低营养培养基R2A和高pH培养基（Horikoshi和R2A pH 9.2）进行富集培养，分离形态 distinct的菌落，并通过MALDI-TOF MS和16S rRNA基因测序进行鉴定和去冗余。排除生物安全等级2的菌株后，最终获得12株 isolates。

菌株维护与选择：菌株在胰蛋白酶大豆肉汤（TSB）或琼脂（TSA）中培养，生长条件为28°C、140 RPM。通过微孔板实验测试菌株在pH 10和pH 11的TSB中的生长能力，筛选出4株在pH 11下生长良好的 isolates。进一步通过血清瓶实验测量CO₂生产能力，选择CO₂产量高的菌株（S. clausii LMG 33235和S. patagoniensis LMG 33400）。

适应性实验室进化：对S. clausii进行10次传代培养（约34代），在pH 11的TSB中提升其耐碱性。进化后的菌株（S. clausii t10 LMG 33236）生长速率和最大OD显著提高。

微生物活性测量与石灰砂浆碳化：在血清瓶中培养菌株，监测O₂和CO₂浓度、pH和细胞数量（流式细胞术）。并行实验将石灰砂浆样品与细菌悬浮液共孵育，通过热重分析（TGA）量化碳化程度。使用理想气体定律和亨利定律计算总无机碳含量。

石灰糊体碳化：将细菌悬浮液直接与石灰混合制备糊体，通过TGA、傅里叶变换红外光谱（FTIR）和酚酞喷涂分析碳化进程。评估碳化百分比、层间碳化差异以及有机相的存在。

统计分析：使用双因素方差分析（ANOVA）和Tukey事后检验比较不同菌株和时间点的差异，显著性水平设为α=0.05。

结果

分离与菌株选择：从石灰砂浆中分离出33株细菌，经MALDI-TOF和16S测序得到12株非致病性 isolates，主要为Shouchella、Bacillus和Staphylococcus属。5株菌在pH 10下生长良好，4株在pH 11下生长（S. clausii和S. patagoniensis生长最快）。CO₂生产实验显示S. clausii、S. patagoniensis和一株未命名 isolate 具有快速CO₂生产能力，最终选择S. clausii和S. patagoniensis进行深入研究。

适应性进化：S. clausii经10次传代后，生长速率提高，表明对高pH环境适应性增强。

微生物活性：S. patagoniensis在血清瓶中表现出最高的细胞浓度和最快的O₂消耗速率，并在第14天测得headspace CO₂浓度（最高1.09%），估算总无机碳产量达160 mmol/L。S. clausii t10的细胞数量高于原始菌株，但CO₂产量较低。流式细胞术显示S. patagoniensis的完整细胞数量最高，且开瓶补氧后细胞活性迅速恢复。比耗氧率表明S. clausii代谢活性最高，可能源于环境应激。

石灰砂浆碳化：S. patagoniensis悬浮液在7天和14天均显著提高石灰砂浆碳化程度（较对照组提高约5%–10%），但碳化在14天后趋于饱和。

石灰糊体碳化：直接混合细菌悬浮液抑制了早期碳化，但改变了碳化动力学——TSB和细菌糊体的碳化呈线性增长，而水对照组为对数增长。FTIR检测到有机相特征峰（1500–1700 cm^?1和3000–3600 cm^?1），TGA显示25–250°C质量损失（有机 matter）。酚酞喷涂发现李泽冈环现象，即碳化区域被未碳化区域夹持，表明有机添加物 alters碳化前沿进展。

讨论

本研究验证了利用细菌CO₂生产加速石灰碳化的可行性。S. patagoniensis因最佳耐碱性和CO₂产量成为最有潜力的菌株，其CO₂生产速率（约1.39×10^?4 mmol/L/s）接近石灰最大CO₂吸收速率的下限，表明微生物策略可有效提升早期碳化。然而，细菌直接混合会短期抑制碳化，主要源于TSB培养基中的NaCl和葡萄糖等成分的干扰。李泽冈环的形成提示有机添加物改变了碳化动力学，可能通过影响CaCO₃成核和扩散过程实现更均匀的碳化，这与生物矿化中EPS调控晶体形态的机制一致。

实际应用中，培养基成本、盐分残留（可能导致盐损伤）以及细菌在高pH环境下的存活率是关键挑战。未来研究需优化菌株培养条件（如低成本培养基）、探索EPS的作用机制，并评估细菌添加对石灰材料长期耐久性和力学性能的影响。与碳酸酐酶或金属有机框架等新兴碳化加速技术相比，微生物策略的优势在于可持续性和潜在的双重功能（CO₂生产+生物矿化调控）。

结论

细菌介导的碳化策略为克服石灰硬化慢的局限提供了新途径，S. patagoniensis展现出最优的耐碱性和CO₂生产能力。尽管直接混合会暂时抑制碳化，但有机添加物诱导的碳化动力学变化（如李泽冈环）可能改善材料均匀性和长期性能。本研究为开发绿色、兼容历史的生物基石灰材料奠定了理论基础，后续需聚焦菌株优化、机制阐释和实际应用评估。