DNA腺嘌呤甲基化会影响变形链球菌（Streptococcus mutans）的基因表达和生物膜形成

《Applied and Environmental Microbiology》：DNA adenine methylation influences gene expression and biofilm formation in Streptococcus mutans

研究揭示链球菌 mutans 的 DNA 甲基化系统（DAM）通过调控外多糖合成和膜小泡介导的 extracellular DNA（eDNA）水平影响生物膜形成。ΔRM 突变体因缺乏 DAM 导致生物膜附着力下降、eDNA 显著增加，并通过 upregulation 嘌呤合成基因和 downregulation 关键 virulence 基因（如 gtfC）改变生物膜结构，为靶向甲基化治疗生物膜感染提供新思路。

　　在人类口腔环境中，一种名为 *Streptococcus mutans*（简称 *S. mutans*）的细菌是导致龋齿（即牙齿腐蚀）的主要病原体之一。这种细菌以其独特的生物膜形成能力而闻名，这种能力不仅影响其在牙齿表面的附着，还决定了其在宿主环境中的生存和致病潜力。生物膜是一种由细菌自身分泌的复杂结构组成，其中包括细胞外DNA（eDNA）、蛋白质和多糖等成分，这些成分共同构成了生物膜的骨架，增强了其对宿主免疫系统和抗菌药物的抵抗力。近年来，研究发现DNA甲基化在细菌的生理调节和致病性调控中起着重要作用，尤其是在 *S. mutans* 中，DNA甲基化不仅参与自身DNA的保护，还可能通过调控基因表达来影响生物膜的形成。

DNA甲基化是一种表观遗传修饰过程，它通过在特定的DNA位点添加甲基基团来改变基因表达。在 *S. mutans* 中，DNA甲基化主要涉及腺嘌呤的N6位点，尤其是在5′-GATC-3′序列中。这种甲基化由DpnII限制修饰（R-M）系统负责，该系统包含甲基转移酶和限制酶两种酶，分别负责将甲基基团添加到宿主DNA上以及切割未甲基化的外来DNA。R-M系统在细菌的先天免疫中发挥关键作用，防止病毒和噬菌体侵入。然而，除了其防御功能，R-M系统还可能通过调控基因表达来影响细菌的生理行为，包括生物膜的形成。

在本研究中，我们探讨了 *S. mutans* 中DNA甲基化缺失（即ΔRM突变体）对生物膜形成的影响。ΔRM突变体由于缺乏腺嘌呤甲基化，其生物膜表现出显著的脆弱性，容易从表面脱落。此外，ΔRM突变体的生物膜中细胞外多糖（exopolysaccharides）含量明显减少，而eDNA的水平却显著增加。这一现象可能与膜泡（membrane vesicles, MVs）的产生有关，而非细胞裂解导致的eDNA释放。通过转录组分析，我们发现只有少数与生物膜形成直接相关的基因表达发生了显著变化，例如 *gtfC* 基因，该基因编码一种关键的糖基转移酶，负责合成促进生物膜形成的葡聚糖。这表明，生物膜缺陷可能是由于间接的调控机制或替代的基因表达路径造成的。

值得注意的是，ΔRM突变体中与mutanobactin相关的基因表达被下调，而参与嘌呤核苷酸从头合成的基因则被上调。mutanobactin是一种非核糖体合成的脂蛋白，它在细菌的氧化应激反应中起重要作用，同时可能参与调节膜泡的形成与释放。相反，嘌呤核苷酸的合成可能在生物膜形成过程中发挥关键作用，因为这些分子可能为生物膜的构建提供必要的物质基础。这一发现揭示了DNA甲基化在 *S. mutans* 生物膜形成中的新作用，不仅限于直接的基因调控，还可能通过影响代谢途径间接影响生物膜的稳定性。

生物膜的形成是一个复杂的过程，涉及多种细菌之间的相互作用以及与环境的协调。除了传统的基因调控机制，如转录因子和细胞间通讯系统，生物膜的构建还受到多种表观遗传修饰的影响。在 *S. mutans* 中，CSP-ComDE系统是一种重要的细胞间通讯机制，它通过调节基因表达来控制生物膜的形成。此外，该系统还与DpnII R-M系统的表达相关，这表明DNA甲基化可能在调控生物膜相关基因的表达中起到关键作用。例如，CSP-ComDE系统不仅影响遗传转化能力，还可能通过调控DpnII R-M系统的表达来影响生物膜的形成。这种调控机制为理解细菌如何在不同环境中协调其生存策略提供了新的视角。

在研究ΔRM突变体时，我们发现其生物膜结构发生了显著变化。虽然其生物膜整体厚度有所增加，但细胞外多糖的含量明显减少，这可能导致生物膜结构的不稳定性。同时，eDNA的增加可能与膜泡的大量释放有关，因为膜泡是细菌释放生物活性分子的重要载体。通过扫描电子显微镜（SEM）观察，我们发现ΔRM突变体的生物膜在结构上与野生型（WT）生物膜存在差异，这可能与细胞间相互作用和生物膜基质的组成变化有关。然而，进一步的研究表明，这些变化并非源于细胞表面特性的改变，而是与生物膜基质的组成和结构有关。

此外，我们还发现DNA甲基化对基因表达具有调控作用。例如，在 *S. mutans* 中，*purC* 基因的表达受到DNA甲基化的调控。该基因编码一种关键的嘌呤合成酶，其表达水平的变化可能影响生物膜中eDNA的积累。通过突变实验，我们发现当 *purC* 基因的启动子区域中的GATC位点被破坏后，该基因的表达显著增加，这进一步支持了DNA甲基化在调控基因表达中的作用。这一发现不仅揭示了DNA甲基化在 *S. mutans* 中的表观遗传调控功能，还提示了其在细菌适应性和致病性中的潜在作用。

研究还发现，ΔRM突变体的生物膜形成缺陷可能与多个代谢途径的变化有关。例如，我们观察到ΔRM突变体中与组氨酸生物合成相关的基因表达受到抑制，这可能影响生物膜的稳定性。同时，与嘌呤代谢相关的基因表达增加，这可能为生物膜的构建提供更多的能量和原料。这些代谢变化可能通过影响细胞外基质的组成和结构，间接导致生物膜的不稳定性。因此，DNA甲基化可能通过调控代谢途径来间接影响生物膜的形成。

总体而言，本研究揭示了DNA甲基化在 *S. mutans* 生物膜形成中的重要作用。通过比较ΔRM突变体与野生型菌株，我们发现DNA甲基化的缺失不仅影响了生物膜的结构，还可能通过改变基因表达模式和代谢途径来影响生物膜的稳定性。这些发现为理解细菌如何通过表观遗传机制调节其生理行为提供了新的思路，同时也为开发针对生物膜相关感染的新型抗菌策略提供了理论依据。由于DNA甲基化在哺乳动物细胞中较为罕见，因此针对该机制的干预可能具有较高的特异性，减少对宿主细胞的毒性风险。未来的研究可以进一步探索DNA甲基化在其他细菌中的作用，以及其在不同环境条件下的调控机制。