亚热带河流微真核生物生境特化种较泛化种展现更强的确定性过程及生物多样性与营养循环关联

本研究系统揭示了亚热带河流中微真核生物泛化种（generalists）与特化种（specialists）在群落构建、互作网络及生态功能上的分化。特化种表现出更强的确定性过程驱动、更高的网络连通性及稳定性，并通过更强的β多样性与多营养循环（BNC）关联，凸显其在维持河流生态系统功能中的核心作用。该研究为理解微生物功能群生态机制提供了新视角。

　　

ABSTRACT

微真核生物泛化种和特化种对环境敏感性的差异显著影响群落动态及水生生态系统功能。本研究通过亚热带河流的实地调查，发现特化种较泛化种受确定性过程控制更强，共现网络分析显示特化种互作更紧密且对网络稳定性贡献更大。尤为重要的是，特化种在维持营养循环中发挥不成比例的重要作用。该研究阐明了微真核生物泛化种和特化种的不同生态响应，强调了特化种在维持生态系统稳定性与功能中的关键角色。

INTRODUCTION

河流生态系统作为水循环的重要载体，在维持生物地球化学循环中具有不可替代的作用。微真核生物作为河流生态系统的重要组成部分，参与营养循环和污染物降解等关键功能。近年来研究表明，全球变化因素通过调节生物多样性严重影响生态系统功能。鉴于真核生物群落对环境变化响应迅速，这些变化可能直接或通过级联效应间接影响水生生态系统功能。因此，全面理解微真核生物群落的驱动因素对维持河流生态系统功能至关重要。

生态学研究中，理解生物多样性维持机制是核心议题。生态位理论和中性理论为理解微生物群落构建提供了互补框架。微真核生物根据其生态位适应能力可分为泛化种和特化种。泛化种通常表现出较宽的生态位宽度和较强的环境耐受性，而特化种具有较窄的生态位宽度，对环境变化敏感且分布有限。这些生态位差异可能导致两组群落在群落构建过程中存在显著差异。

微生物不是孤立个体，它们嵌入复杂的微生物群落中，与多种其他微生物相互作用。共现网络可用于探索微生物互作。特化种在多样性中占绝对优势，近期研究表明特化种在维持种间互作和网络稳定性方面发挥重要作用。特化种表现出高多样性和功能特异性，它们依赖其他群落成员获取必需资源，同时在其偏好生态位保持竞争优势，从而在支持生态系统稳定性方面发挥关键作用。

生态系统可同时提供多种功能和服务，营养循环作为关键生态过程在维持生态系统结构和功能中发挥核心作用。营养循环效率直接决定水生生态系统中初级生产者的生物量，进而通过食物网级联效应影响整个生态系统功能。微真核生物如原生动物和微藻是水生生态系统生物地球化学循环过程的关键驱动者。这些微生物通过参与碳（C）、氮（N）等元素循环过程调节生态系统内的物质流动和能量转移。多营养循环指数已被用于探索陆地生态系统中的生物多样性-营养循环关系，但河流生态系统中微真核生物多样性与多营养循环的关系仍待深入探索。

MATERIALS AND METHODS

研究在福建省西部最大河流汀江（116°19′–116°37′E, 24°59′–25°24′N）沿水流方向设置30个采样点，于2015年7月（丰水期）和11月（枯水期）分别采样，共获得60个样本。测量包括水温、溶解氧（DO）、电导率（EC）、浊度、pH、流速、悬浮固体、氧化还原电位（ORP）、叶绿素a（Chl-a）、总碳（TC）、总有机碳（TOC）、总氮（TN）、总磷（TP）、铵态氮（NH₄-N）、硝态和亚硝态氮（NO_x-N）、磷酸盐磷（PO₄-P）、砷（As）和重金属（Cr、Cu、Zn、Cd、Hg、Pb）等24个环境因子。

使用FastDNA spin kit提取微真核生物DNA，针对真核生物18S rRNA基因V9区使用通用引物1380F和1510R进行PCR扩增。使用FLASH合并测序双端 reads，QIIME v.1.8.0去除低质量reads，UCHIME识别并去除嵌合体序列。使用97%序列相似度 cutoff 通过UPARSE将序列聚类为OTUs。代表序列与SILVA（Release 123）参考比对使用RDP分类器进行对齐。

统计分析

生境泛化种和特化种的识别

基于生态位宽度识别生境泛化种和特化种。生态位宽度使用公式B_j = 1/∑_i=1^NP_ij²计算，其中B_j表示OTU j的生态位宽度，N为群落总数，P_ij为OTU j在群落i中的比例。较高B值表示OTU存在且分布更均匀。为避免低丰度类群误判为特化种，平均相对丰度<2×10^?5的OTU不予考虑。通过1000次随机置换生成零分布，观察到的生态位值超出零分布95%置信区间上限或下限的OTU分别归类为泛化种和特化种。

群落组成和多样性分析

通过标准化OTU读取计数计算微生物类群相对丰度。使用"vegan"包计算微真核生物泛化种和特化种的alpha多样性指数（如Richness、Chao1和ACE）。使用Wilcoxon秩和检验比较泛化种和特化种alpha多样性差异。基于Bray-Curtis相异度评估beta多样性，使用非度量多维尺度分析（NMDS）可视化群落组成差异。

环境驱动和距离衰减关系分析

使用约束主坐标分析（CAP）评估环境因子对微真核生物泛化种和特化种群落组成的影响。使用树状网络长度表征空间距离，通过普通最小二乘回归确定微真核生物群落Bray-Curtis相似性与环境因子欧氏距离和采样点地理距离的关系。

群落构建机制

使用"NST"包基于归一化随机比评估随机性和确定性对群落构建的相对重要性。NST<50%表明更高确定性，NST>50%表明随机性占优。使用Stegen等人描述的零模型框架将生态过程分为确定性过程（同质选择和异质选择）和随机过程（扩散限制、同质扩散和未支配）。通过β最近分类单元指数（βNTI）和Bray-Curtis基于Raup-Crick（RC_Bray）评估系统发育和分类多样性变异。

共现网络构建

使用"igraph"包构建包含泛化种和特化种所有成员的元群落共现网络。保留出现频率>80%且平均相对丰度>0.05%的OTU，使用稳健相关性（Spearman相关系数r > 0.6）和FDR校正P < 0.05构建网络。计算平均路径长度、网络直径、网络密度、度数和介数等拓扑指标。使用自然连接性和凝聚指数评估网络稳定性。

多营养循环指数测量

基于总碳（TC）、总有机碳（TOC）、总氮（TN）、铵态氮（NH₄-N）、硝态氮（NO₃-N）、亚硝态氮（NO₂-N）、总磷（TP）和磷酸盐磷（PO₄-P）八个关键营养参数计算多营养循环指数。各变量使用公式（X_raw - X_min）/（X_max - X_min）标准化至0-1范围，标准化变量取平均得复合指数。

生物多样性与多营养循环关联

使用普通线性回归探索泛化种和特化种β多样性与多营养循环的关系。使用随机森林（RF）模型比较泛化种和特化种对多营养循环的贡献。基于偏最小二乘路径模型（PLS-PM）评估环境和空间因子介导的泛化种和特化种β多样性如何影响多营养循环。

RESULTS

泛化种和特化种的群落组成和多样性

分类相对丰度分析显示泛化种保持稳定群落，以Stramenopiles（丰水期：24.7%；枯水期：26.7%）、Alveolata（丰水期：20.8%；枯水期：19.4%）和Chloroplastida（丰水期：17.4%；枯水期：20.9%）为主。特化种从Stramenopiles（丰水期：31.6%）和Alveolata（丰水期：21.2%）优势转变为Fungi（枯水期：53.2%）和Chloroplastida（枯水期：15.1%）优势。特化种在丰水和枯水期均表现出更高的Richness、ACE和Chao1 alpha多样性。特化种Bray-Curtis相异度显著高于泛化种，表明其具有更高β多样性。NMDS分析和PERMANOVA显示泛化种和特化种群落组成在季节间存在显著差异，特化种群落受季节变化影响更大。

环境驱动和距离衰减关系

CAP分析显示泛化种和特化种变异由不同环境因子决定，主要包括营养盐和重金属。丰水期TOC、EC和As是影响泛化种组成的主要驱动因子，特化种主要受As、Turb和TP影响。枯水期泛化种受NO₃-N、pH、As、TOC和Cu影响，特化种对多种环境因子更敏感，包括As、NO₃-N、TOC、Cu、Cd、Temp和流速。系统发育树分析显示优势泛化种类群相对丰度高于特化种且季节间变化不大，优势特化种类群受重金属、营养盐和河流物理性质（如温度和流速）共同影响。

线性回归显示丰水期泛化种无显著距离衰减，特化种表现出较弱生物地理模式（r = -0.04）。枯水期泛化种和特化种均呈现显著距离衰减，特化种斜率略陡（r = -0.38）。环境距离衰减呈现类似模式，特化种群落与环境距离的关系略强于泛化种。

群落构建过程

NST和零模型分析显示微真核生物泛化种和特化种生态过程相对重要性存在显著差异。Mantel相关图在较短系统发育距离检测到显著正系统发育信号。泛化种NST值在季节间均高于50%边界，表明随机过程在其群落构建中占更突出地位。特化种NST值在丰水期低于50%边界，枯水期多数低于50%，表明确定性过程对其群落构建更重要。零模型结果显示随机过程（包括同质扩散、扩散限制和未支配）解释泛化种群落构建的94.6%（丰水期）和90.5%（枯水期），而仅解释特化种群落构建的77.1%（丰水期）和76.9%（枯水期）。两种分析均表明微真核生物特化种较泛化种表现出更强确定性。

共现网络分析

分别为微真核生物泛化种和特化种构建的共现网络显示特化种网络具有更短平均路径长度、更小网络直径、更高网络密度和平均度数。节点水平特化种网络显示显著更高度数和介数。特化种网络自然连接性和凝聚绝对值显著高于泛化种，表明其具有更高复杂性和更强种间互作。

Zi-Pi图显示网络中枢、模块中枢和连接器被确定为潜在关键种。移除关键种显著降低自然连接性（斜率：丰水期-0.27；枯水期-0.35），而随机移除物种影响较小（斜率：丰水期-0.03；枯水期-0.05）。大多数关键种属于特化种，稳健性分析显示移除特化种时网络连接性下降最快。结果表明特化种网络具有更强抗干扰能力，在维持网络结构和稳定性中发挥重要作用。

微生物多样性与多营养循环关联

普通线性回归显示微真核生物特化种β多样性对丰水期多营养循环解释贡献最大，泛化种β多样性与多营养循环无显著关系。随机森林算法识别前30个预测OTU中特化种占较大比例，表明其是多营养循环的重要预测因子。结构方程模型（SEM）量化微真核生物泛化种和特化种多样性对多营养循环的贡献，在考虑空间、环境属性和群落构建等多重驱动因子后，特化种β多样性对多营养循环仍存在正向直接效应，泛化种β多样性无显著影响。

DISCUSSION

微真核生物泛化种和特化种多样性差异模式

研究结果显示少量微真核生物泛化种和大量特化种共存，两者多样性在季节间存在显著差异。泛化种占据更宽生态位宽度且分布广泛，但多样性显著低于特化种。特化种通常占据狭窄生态位且易受强环境过滤影响，导致物种适应性分化。其生存生境碎片化程度高，物种易受地理隔离影响，导致基因流受限，可能经历更频繁的物种形成。特化种群落季节变化较泛化种更显著，可能与亚热带河流环境条件强烈波动相关，这种高环境异质性驱动对环境变化更敏感的特化种群落发生显著季节性动态调整。

生物地理模式描述物种时空分布，群落构建揭示这些分布模式背后的维持机制。特化种表现出略强环境距离衰减模式，可能因其面对环境过滤时表现出更高敏感性。特化种还表现出略强距离衰减模式，虽然差异幅度较小，但模式符合生态位理论预测。枯水期两者均呈现显著距离衰减模式，可能与枯水期河流连通性显著降低相关，从而对微真核生物扩散施加更强限制。环境过滤和扩散限制共同塑造泛化种和特化种群落。

生境特化种较泛化种展现更强确定性

理解群落构建机制是微生物生态学核心议题。生境泛化种具有更大代谢灵活性，在频繁干扰环境中占优，而特化种在稳定环境中占主导，暗示两者群落构建机制存在差异。特化种受更强确定性过程影响，与河流生态系统和城市影响生态系统先前发现一致。泛化种因更宽生态位宽度受环境过滤影响较小，故更易受随机扩散影响。此外，泛化种显示更高休眠潜力，该特性促进环境压力下恢复力并助力扩散成功。相比之下，特化种具更窄生态位宽度，因环境耐受性差在随机扩散中具有高灭绝概率，故在群落构建中更易受确定性过程影响。有证据表明确定性过程主导的群落比较随机过程主导的群落具有更多样功能。在稳定环境条件下，生境特化种对生态系统功能稳定性贡献巨大。当环境波动频繁时，具有高抗干扰性的泛化种成为生态系统功能支柱。泛化种和特化种间的权衡在变化生态背景下影响生态系统健康和功能。

生境特化种展现更高共现网络复杂性和稳定性

共现网络分析表明微真核生物特化种较高网络复杂性和稳定性，暗示特化种间存在更强互作。微生物泛化种可能比较特化种具有更大基因组。自由生活生物可通过适应性基因丢失进化依赖性，这可用黑皇后假说解释。该过程涉及受益者（通过降低基因组复杂性减轻代谢负担优化适应度）和帮助者（维持更大基因组为群落提供公共资源）。泛化种因广泛基因组和蛋白质组 repertoire 更可能成为帮助者，意味着种间互作对泛化种可能非必需。特化种在压力环境中可能经历基因组缩减，因更小基因组提供更大适应益处，实现更高效资源利用并降低代谢负担。丢失基因编码功能可通过与其他群落成员代谢互补获得。因此，微生物特化种倾向于在群落中相互合作。此外，微真核生物特化种网络展现更高稳定性，具有更高自然连接性和负正凝聚绝对值，表明微生物网络复杂性确实支持微生物群落网络结构稳定性。

生态关键类群通过其代谢作用在生态服务中具有重