基于免提取冻干一体化RAA-CRISPR/Cas13a技术的流感嗜血杆菌床旁快速检测新策略

本文推荐一种创新的分子诊断技术——免提取一体化RAA-CRISPR/Cas13a检测法（EFORCA），该技术整合重组酶辅助扩增（RAA）、CRISPR/Cas13a系统与快速裂解工艺，实现了对流感嗜血杆菌（HI）DNA的床旁快速检测（POCT）。其灵敏度达25 CFU/mL，特异性100%，30分钟内完成检测，突破了传统qPCR在低浓度样本检测中的局限，为基层医疗机构提供了一种高效、精准的分子诊断方案。

　　

ABSTRACT

及时准确的诊断对有效治疗流感嗜血杆菌（HI）感染至关重要。目前仍缺乏针对HI DNA的快速床旁检测（POCT）方法。本研究旨在建立一种适用于POCT的一体化CRISPR/Cas13a检测装置。团队成功构建了两步法PCR-CRISPR检测、两步法RAA-CRISPR检测及一体化RAA-CRISPR检测体系，并通过试剂冻干、快速裂解技术与一体化检测装置的整合，开发出名为EFORCA（免提取一体化RAA-CRISPR/Cas13a检测法）的新平台。在90例模拟样本和77例临床样本验证中，两步法PCR/RAA-CRISPR检测的灵敏度达1拷贝/μL，特异性100%；一体化RAA-CRISPR检测和EFORCA分别可在30分钟内检测出细菌悬液中50 CFU/mL和25 CFU/mL的HI。临床样本验证显示，两种方法的灵敏度均达95%，高于qPCR的92.5%，特异性均为100%。本研究开发的EFORCA技术为HI感染的早期诊断与监测提供了有力工具。

IMPORTANCE

本研究通过整合RAA扩增、CRISPR基因编辑技术与快速裂解方法，建立了灵敏度高、特异性强的一体化检测平台EFORCA。该技术具备操作简便、检测快速、成本低廉等优势，特别适合资源有限的小型实验室使用，为HI感染的现场快速诊断提供了突破性解决方案。

INTRODUCTION

流感嗜血杆菌（HI）是一种革兰氏阴性杆菌，分为可分型（荚膜型）和不可分型（无荚膜型）菌株。不可分型HI（NTHi）是儿童中耳炎和呼吸道感染（如肺炎、急性支气管炎）的主要病原体之一，在严重情况下可导致慢性阻塞性肺疾病急性加重。而b型HI（Hib）作为最具毒力的菌株，可引发败血症、肺炎、脑膜炎等侵袭性疾病。尽管Hib疫苗的推广显著降低了其发病率，但感染后的高死亡率及后遗症问题仍不容忽视。

目前HI的诊断主要依赖传统细菌培养、qPCR、16S rRNA测序和MALDI-TOF MS等技术，但这些方法或因耗时长、环境要求高，或因依赖昂贵设备、专业操作人员而难以在基层推广。等温扩增技术如RAA和LAMP虽简化了设备需求，但存在气溶胶污染风险。CRISPR/Cas系统因其高灵敏度与特异性被广泛应用于病原体检测，但RAA与CRISPR系统的整合仍面临试剂干扰、操作复杂等挑战。本研究旨在开发一种新型、快速、精准的HI分子检测方法。

MATERIALS AND METHODS

研究设计了针对HI外膜蛋白P6基因（ompP6）的特异性PCR/RAA引物及crRNA，通过保守区序列比对筛选出最优组合。采用梯度稀释的合成DNA、基因组DNA及细菌悬液进行灵敏度评价，并通过概率回归分析确定检测限（LOD）。特异性测试涵盖肺炎克雷伯菌、肺炎链球菌等16种临床常见细菌。

快速样本裂解优化包括血浆与痰液的不同前处理方式（如直接加裂解液、4% NaOH预处理等）。一体化RAA-CRISPR反应体系将RAA试剂与CRISPR关键组分分装于管底与管盖，通过离心实现混合。EFORCA装置则采用冻干球剂型分舱设计，结合侧流层析试纸条实现结果可视化。

临床样本验证涵盖模拟样本（90例）及真实临床样本（77例），以细菌培养和MALDI-TOF MS结果为金标准，对比qPCR、ddPCR及CRISPR法的性能差异。

RESULTS

两步法RAA-CRISPR检测的构建与优化

通过凝胶电泳与荧光信号分析筛选出最佳引物组合（RAA-F2R3）及crRNA（crRNA2）。灵敏度测试显示，对合成DNA、基因组DNA及细菌悬液的检测限均达1拷贝/μL或10 CFU/mL，优于qPCR（10拷贝/μL或10² CFU/mL）。特异性实验未见交叉反应。侧流层析试纸条法的灵敏度与荧光法相当。

一体化RAA-CRISPR检测的实现

通过优化裂解条件（样本与裂解液比例1:6，痰液添加4% NaOH预处理）及反应体系（42°C扩增15分钟，37°C CRISPR反应10分钟），一体化检测法对细菌悬液、模拟痰液及血浆的检测限为50 CFU/mL，且具备良好特异性（无交叉反应）和重复性（变异系数2.6%）。

EFORCA的性能验证

EFORCA装置整合冻干试剂与一体化设计，对细菌悬液、痰液及血浆的检测限达25 CFU/mL，操作仅需裂解液、移液器与微型恒温器。临床样本测试显示其灵敏度为95%，特异性100%，成本仅为3.5美元/测试。

多方法对比研究

在模拟样本中，两步法PCR-CRISPR、RAA-CRISPR及一体化法的灵敏度分别为96.7%、96.7%和93.3%，特异性均为100%；qPCR灵敏度为91.7%。在临床样本中，CRISPR法灵敏度（95-97.5%）均高于qPCR（92.5%），且EFORCA与一体化法在成本与操作复杂度上更具优势。

DISCUSSION

本研究成功将CRISPR/Cas13a技术与RAA等温扩增结合，攻克了一体化检测中试剂干扰、气溶胶污染等技术难点。EFORCA通过冻干工艺与设备创新，实现了POCT场景下的高效、稳定检测。尽管快速裂解法的灵敏度略低于核酸提取法，但通过前处理优化（如4% NaOH解粘）显著提升了检测效率。该技术有望弥补基层医疗机构在HI感染诊断中的技术空白，推动分子诊断的普惠化应用。

未来研究需进一步优化样本裂解流程，并探索Cas13a系统的定量检测潜力。

ACKNOWLEDGMENTS

本研究受北京市医院管理中心登峰人才培养计划（DFL20221503）、北京市高水平公共卫生技术人才项目、北京自然科学基金昌平创新联合基金（L234046）等资助。