病毒膜磷脂酰丝氨酸（PS）含量差异驱动黄病毒间GAS6结合能力分化及其进入机制研究

本综述深入探讨了黄病毒属成员（寨卡病毒ZIKV、西尼罗河病毒WNV和登革病毒DENV）在利用磷脂酰丝氨酸（PS）受体进入宿主细胞机制中的关键差异。研究首次揭示ZIKV独特性结合生长停滞特异性蛋白6（GAS6）的能力源于其病毒颗粒膜上显著更高的PS含量（与宿主内质网膜水平相当），而WNV和DENV的PS含量极低（仅1.3%和0.9%）。这一发现突破了“病毒膜脂质组成均源于宿主膜”的传统认知，为解释ZIKV特异性利用AXL受体介导神经组织和胎盘感染提供了分子基础，对理解黄病毒致病性差异和靶向脂质组成的抗病毒策略具有重要启示。

　　

引言：黄病毒科的进入机制谜题

黄病毒属包含多种重要人类病原体，如寨卡病毒（ZIKV）、西尼罗河病毒（WNV）、登革病毒（DENV）和黄热病毒（YFV）。这些病毒在序列和结构上具有相似性，但ZIKV独特性地引起先天性感染导致小头畸形等出生缺陷，而WNV主要感染成人中枢神经系统引发炎症性疾病，DENV和YFV则无神经嗜性。病毒进入靶细胞通常由病毒糖蛋白与细胞表面受体结合启动。尽管尚未发现黄病毒特异性进入受体，但已知多种细胞表面分子可促进其感染，包括C型凝集素（如DC-SIGN/CD209和L-SIGN/CD299）和各种磷脂酰丝氨酸（PS）受体。

PS受体的主要生理功能是结合凋亡细胞暴露的PS并介导其吞噬清除（efferocytosis）。许多包膜病毒利用这些PS受体进入细胞，这种策略被称为“凋亡拟态”（apoptotic mimicry）。在PS受体中，T细胞免疫球蛋白粘蛋白（TIM）家族（TIM1、TIM3、TIM4）和TAM家族（TYRO3、AXL、MERTK）受体在黄病毒感染中起关键作用。TIM家族受体直接结合PS，而TAM家族受体通过可溶性介质（主要是生长停滞特异性基因6（GAS6）和蛋白S（ProS））间接结合PS。GAS6是所有三种TAM受体的配体，而ProS仅结合TYRO3和MERTK，因此GAS6是AXL的唯一配体。

此前研究发现，ZIKV能高效利用AXL，而WNV和DENV不能，这种差异源于ZIKV独特性结合GAS6的能力。本研究旨在探究这种差异结合背后的机制。

结果

ZIKV特异性结合GAS6的能力确认

为验证先前发现，研究使用人源细胞系（A549肺上皮细胞和Huh7肝上皮细胞）培养病毒进行GAS6结合实验。病毒与GAS6-Ig（免疫球蛋白融合蛋白）孵育后，通过蛋白A-琼脂糖珠沉淀捕获的病毒颗粒，并通过Western blot（WB）和逆转录定量PCR（RT-qPCR）进行检测。作为阴性对照，使用仅结合AXL但不结合PS的GAS6 C端半段（C-GAS6-Ig）；作为阳性对照，使用可结合所有三种病毒的TIM1-Ig（因其能结合磷脂酰乙醇胺（PE）和PS）。结果显示，ZIKV能有效结合GAS6-Ig，而WNV和DENV不能，C-GAS6-Ig不结合任何病毒，TIM1-Ig结合所有病毒。该结果证实了ZIKV独特性结合GAS6的能力。

病毒成熟度不影响GAS6结合

由于未成熟病毒颗粒因prM-E蛋白三聚体直立排列而暴露更多膜区域，研究假设病毒成熟度可能影响GAS6结合。为验证此假设，通过三种方法降低WNV成熟度：（1）使用furin抑制剂（Decanoyl-RVKR-CMK）处理感染细胞；（2）在28°C低温培养感染细胞（降低成熟度）；（3）在缺乏功能性furin的LoVo细胞中生产完全未成熟的WNV。WB检测显示这些处理成功降低了病毒成熟度（未切割prM条带增多），但GAS6结合实验表明，即使完全未成熟的WNV仍不能结合GAS6-Ig，而TIM1-Ig结合不受影响。这表明病毒成熟度不是GAS6结合差异的原因。

E蛋白N-连接糖基化不影响GAS6结合

病毒蛋白上的N-连接糖基化可能通过空间位阻影响GAS6与病毒膜的结合。研究使用PNGase F处理WNV以去除E蛋白N-糖基化，WB确认E蛋白表观分子量减小（糖基化去除成功）。但PNGase F处理后的WNV仍不能结合GAS6-Ig，表明N-糖基化差异不是导致GAS6结合差异的因素。

病毒磷脂而非病毒蛋白介导ZIKV与GAS6结合

为确认ZIKV与GAS6的结合是由病毒膜磷脂（而非病毒蛋白）介导，研究使用磷脂酶C（PLC）处理ZIKV-GAS6-Ig复合物。PLC可切割磷脂分子中磷酸与甘油之间的键，去除磷脂头基。如果结合由PS介导，PLC处理应解离病毒与GAS6-Ig；如果由蛋白介导，则无影响。结果显示，PLC处理（无论处理顺序）显著减少了ZIKV与GAS6-Ig和TIM1-Ig的结合，RT-qPCR定量验证了这一结果。这表明ZIKV与GAS6的结合确实由磷脂介导。

ZIKV的PS含量显著高于WNV和DENV

既然结合由磷脂介导，研究进一步比较了三种病毒的磷脂组成。病毒在Vero细胞中培养并通过酒石酸钾梯度离心纯化，WB和考马斯蓝染色验证病毒纯度。通过二维薄层色谱（2D TLC）分析病毒脂质提取物，并以Vero细胞内质网（ER）膜脂质作为对照。结果显示，ZIKV的PS含量（5.8%）与Vero ER膜（6.7%）相当，而WNV和DENV的PS含量极低（分别为1.3%和0.9%）。ZIKV的PS含量是WNV和DENV的4.5-6.4倍。其他磷脂如磷脂酰胆碱（PC）和PE在各病毒间大致相当，但磷脂酰肌醇（PI）在所有病毒中均高于ER膜（13.5%-17.3% vs 9.2%）。脂质ELISA验证GAS6仅结合PS，TIM1结合PE和PS，PI在高浓度时微弱结合但无法解释结合差异。这些数据表明ZIKV的高PS含量是其独特性结合GAS6的原因。

病毒感染不差异改变ER膜磷脂组成

为探究病毒PS含量差异的起源，研究分析了病毒感染是否差异改变ER脂质组。在病毒感染高峰期（ZIKV和WNV感染后2天，DENV感染后6天）提取Vero细胞ER膜脂质，2D TLC分析显示病毒感染未显著改变ER磷脂组成，不同病毒感染的ER磷脂比例也无显著差异。这表明病毒感染本身不改变ER脂质组，病毒颗粒PS含量差异可能源于病毒自身或病毒复制组装过程。

讨论

本研究揭示了黄病毒间GAS6结合能力差异的分子机制：ZIKV病毒颗粒膜含有与宿主ER膜相当的PS水平（~6%），而WNV和DENV的PS含量极低（<1.5%）。这一发现突破了“包膜病毒膜脂质均源于宿主膜”的传统认知，表明病毒本身或其组装过程可主动调控膜脂质组成。

病毒成熟度和E蛋白糖基化被排除为影响因素，PLC实验证实结合由磷脂介导。2D TLC量化显示ZIKV的PS含量是WNV和DENV的4.5-6.4倍，且脂质ELISA证实GAS6特异性结合PS。ER脂质组分析表明病毒感染不改变宿主ER磷脂比例，提示病毒PS含量差异可能源于病毒复制位点的空间异质性——例如，线粒体相关膜（MAM）亚结构域富含PS，ZIKV或在此处组装从而获得更高PS。

这一发现具有重要生物学意义：ZIKV通过高PS含量高效利用AXL受体，后者在免疫特权部位（如脑和胎盘）高表达，这解释了ZIKV的神经嗜性和先天性感染特性。相反，WNV和DENV的低PS限制其AXL使用，可能转向其他进入途径（如TIM1利用PE）。该研究为理解黄病毒致病性差异提供了脂质视角，并为靶向病毒脂质组的抗病毒策略开辟了新途径。