三结构域蛋白28（TRIM28）的胞质易位通过促进Vps34-Beclin1复合物形成在PRRSV诱导的自噬中起关键作用

本研究揭示了猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）通过其非结构蛋白Nsp4介导宿主蛋白TRIM28的核质转运（CRM1依赖途径），进而促进Vps34-Beclin1复合物形成并诱导自噬的分子机制，为理解PRRSV与宿主互作及开发抗病毒策略提供了重要见解。

　　

ABSTRACT

自噬作为一种高度保守的细胞代谢调控机制，在病毒感染过程中扮演"双刃剑"角色。猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）作为尼多病毒目动脉炎病毒科成员，能够在体外和体内诱导细胞自噬，但其诱导自噬的直接或间接因果关系尚不明确。含三结构域蛋白28（TRIM28）被鉴定为自噬相关因子，但其在PRRSV感染过程中与自噬的关系尚未明确。本研究揭示了PRRSV感染过程中自噬和TRIM28的动态变化，发现PRRSV Nsp4通过CRM1依赖途径介导TRIM28的核输出，促进Vps34-Beclin1复合物形成并最终启动自噬过程。作为宿主蛋白，TRIM28具有一定抗病毒作用，但机制不清。本研究首次详细阐明了PRRSV介导自噬的机制，为理解猪繁殖与呼吸综合征的发病机制提供了宝贵信息。

INTRODUCTION

PRRSV是影响全球养猪业的重大疾病病原体，感染后可导致各年龄段猪的呼吸道疾病和母猪繁殖障碍。PRRSV基因组为约15 kb的正链RNA，包含至少10个开放阅读框（ORFs），其中ORF1a和ORF1b编码16种病毒非结构蛋白（Nsps）。这些Nsps在PRRSV生命周期中发挥重要作用，包括参与PRRSV诱导的自噬过程。

自噬是一种进化保守的高度调控的分解代谢过程，涉及将胞质成分递送至溶酶体进行清除和再循环。自噬膜的形成由III类磷脂酰肌醇3-激酶（即空泡蛋白分选34，Vps34）启动，其将磷脂酰肌醇转化为磷脂酰肌醇-3-磷酸并与Vps34/Beclin1形成复合物。自噬膜的延伸需要两个泛素样蛋白结合系统：Atg5–Atg12和LC3的处理。

TRIM28（又称KAP1或TIF1）最初被鉴定为KRAB结构域含锌指蛋白的核共抑制因子。它通过与这些蛋白相互作用靶向特定基因组区域，并通过与HP1亚型的相互作用调节转录。此外，TRIM28还调节RNA聚合酶II（Pol II）依赖性转录的起始和延伸，并参与细胞分化、DNA损伤应答、肿瘤发生、细胞因子产生、病毒复制、干细胞多能性、胚胎发育和自噬等细胞活动。

PRRSV感染诱导自噬并伴随胞质TRIM28增加

通过免疫荧光和Western blot分析，发现在TA-12和VR2332毒株感染的Marc-145细胞和3D4/21-CD163细胞中，感染36小时后LC3斑点显著增加，表明自噬被诱导。从感染12小时开始，在TA-12感染的Marc-145细胞、3D4/21-CD163细胞和PAM细胞中均观察到LC3I向LC3II的转化。这些结果进一步证实了PRRSV感染细胞中的自噬现象。

同时，研究发现PRRSV感染增加了胞质中的TRIM28水平。在TA-12和VR2332分离株感染过程中，Marc-145细胞、3D4/21-CD163细胞和猪肺泡巨噬细胞（PAMs）的胞质TRIM28均有所增加。而SEV和EMCV对照感染并未增加胞质TRIM28。这些累积结果表明PRRSV感染同时诱导自噬和胞质TRIM28增加。

PRRSV感染导致TRIM28从核向质重新定位

TRIM28作为已知的转录调节因子主要定位于细胞核。为阐明PRRSV感染期间胞质TRIM28的来源，研究人员分析了TRIM28的mRNA水平。qRT-PCR分析显示，与对照组相比，TA-12或VR2332感染的Marc-145和3D4/21-CD163细胞中TRIM28基因水平没有显著变化，表明PRRSV感染影响的是TRIM28的定位而非数量。

通过核质分离实验和免疫荧光分析，Western blot分析证明TA-12和VR2332感染降低了核TRIM28蛋白并增加了胞质TRIM28蛋白。免疫荧光染色证实了PRRSV感染的Marc-145细胞和PAMs中TRIM28从核向质的重新定位。这些发现证明了PRRSV在体外诱导TRIM28从核向质的重新定位。

Nsp4通过CRM1途径介导TRIM28重新分布

在PRRSV感染过程中，Nsps促进宿主细胞蛋白的核转位。为研究Nsps在TRIM28重新定位中的作用，研究人员构建了编码PRRSV Nsps的质粒。共转染实验结果表明，只有Nsp4能够促进TRIM28在Marc-145和HeLa细胞中的胞质重新定位，且TRIM28与Nsp4共定位。

通过共免疫沉淀（Co-IP）实验，证实了Nsp4与TRIM28之间的相互作用。在HEK-293T细胞中，使用GFP抗体进行Co-IP，随后的Western blotting显示Co-IP产物中同时存在Nsp4和TRIM28。这些发现表明Nsp4-TRIM28相互作用将TRIM28从核重新分布到胞质，降低了其核丰度。

接下来研究了TRIM28运输对核输出受体CRM1的依赖性。使用CRM1抑制剂Leptomycin B（LMB）处理Marc-145细胞，Western blotting和免疫荧光分析显示LMB处理阻止了TRIM28从核向质的转位，表明CRM1参与了PRRSV诱导的TRIM28转移。

通过Co-IP实验进一步证实了CRM1与TRIM28之间的相互作用。研究发现Nsp4增强了TRIM28与CRM1之间的相互作用，并且TRIM28的RBCC结构域是这种相互作用的关键。这些数据表明PRRSV Nsp4诱导的TRIM28从核向质的转移是CRM1依赖性的，其中RBCC结构域起关键作用。

PRRSV感染诱导的自噬依赖于TRIM28

PRRSV感染诱导的自噬与TRIM28运输相关，表明TRIM28在PRRSV诱导的自噬中起作用。为确定PRRSV诱导的自噬是否依赖于TRIM28，研究人员使用靶向TRIM28的siRNA在Marc-145和3D4/21细胞中敲低TRIM28。

在TRIM28敲低细胞中，PRRSV感染未能在感染后12、24和36小时诱导LC3I向LC3II的转化。免疫荧光分析也显示TRIM28敲低后Marc-145细胞中LC3斑点显著减少。这些发现表明抑制TRIM28表达阻碍了PRRSV诱导的自噬。这些证据共同证明PRRSV诱导的自噬依赖于TRIM28的参与。

TRIM28通过与VPS34相互作用介导PRRSV诱导的自噬

鉴于PRRSV感染诱导的自噬依赖于TRIM28，研究人员进一步研究了TRIM28作为自噬调节因子与自噬相关蛋白的相互作用。Vps34（又称PI3K催化亚单位III型，PI3KC3）是一种核心自噬蛋白，与Beclin1、Vps15和ATG14L形成复合物。

在TA-12感染的Marc-145和3D4/21细胞中，Western blot分析显示Vps34和Beclin1上调。Co-IP实验表明PRRSV感染增强了TRIM28与Vps34之间的相互作用。同时，研究发现CRM1介导的TRIM28核输出对TRIM28-Vps34相互作用有影响：PRRSV感染增强了GFP-TRIM28/内源性TRIM28与Vps34之间的相互作用，而LMB处理削弱了这种相互作用。

鉴于Vps34-Beclin1复合物在自噬诱导中的重要性，研究人员还研究了PRRSV感染期间Vps34与Beclin1之间的相互作用。Co-IP实验证实Vps34与Beclin1之间的相互作用在PRRSV感染后显著增强。此外，Co-IP分析表明，在Marc-145或3D4/21细胞中敲低TRIM28后，Vps34和Beclin1之间的相互作用较弱。这些数据揭示TRIM28直接与Vps34相互作用，并调节Vps34-Beclin1相互作用以诱导自噬。

TRIM28调节PRRSV复制

自噬与病毒复制密切相关，研究人员还考察了TRIM28介导的自噬诱导是否影响病毒复制。通过敲低Marc-145细胞中的TRIM28，发现在PRRSV感染后，TRIM28敲低显著增加了PRRSV拷贝数，特别是在48小时。免疫荧光显示TRIM28敲低后36小时病毒N蛋白水平升高，Western blotting也证实了这一结果。

相反，TRIM28过表达减少了24和48小时感染后的病毒拷贝数（最明显在48小时）并降低了N蛋白水平。为确定TRIM28的核转位是否调节PRRSV复制，研究人员用CRM1抑制剂LMB处理Marc145细胞。LMB处理增加了病毒拷贝数（特别是在36小时）并增强了N蛋白表达，表明TRIM28的核保留抑制PRRSV。这些数据共同证明TRIM28的表达和核定位抑制PRRSV复制。

DISCUSSION

PRRSV感染诱导的自噬已在体外和体内得到研究，但病毒-宿主相互作用的机制尚未完全了解。本研究发现，在PRRSV感染期间，Nsp4通过CRM1途径诱导TRIM28从核向质重新分布，与VPS34和Beclin1形成复合物以触发自噬。TRIM28的这种输出可能是宿主防御机制。

本研究首次阐明了PRRSV感染诱导自噬的潜在机制和TRIM28的动态变化，为了解宿主抗病毒机制提供了理解。TRIM28已被证明是自噬相关因子，在PRRSV感染期间从核重新定位到胞质。PRRSV Nsps已知在感染期间介导宿主细胞蛋白的核转位。基于这些研究，研究人员假设Nsps有助于PRRSV感染期间的TRIM28转位。通过构建PRRSV Nsps和TRIM28的质粒，发现Nsp4是唯一与胞质中TRIM28相互作用的Nsp。

大核蛋白（>50 kDa）的输出依赖于输出适配蛋白Nmd3，其提供核输出信号（NES）。富含亮氨酸的NES被输出受体CRM1识别，促进通过核膜中的核孔复合物通过。先前未报道TRIM28输出是否需要运输受体。本研究中，Western blotting和免疫荧光结果显示TRIM28从核向质的转位与PRRSV感染期间上调的CRM1同时发生，表明存在CRM1依赖的核输出途径。

另一个有趣的观察是TRIM28转位和自噬在PRRSV感染的Marc-145细胞中同时发生。TRIM28参与自噬已在胶质母细胞瘤中报道，其中癌症特异性MAGE-A3/6-TRIM28泛素连接酶对AMP活化蛋白激酶（AMPK）的泛素化和降解抑制癌细胞中的自噬。这些观察提出了自噬是直接由PRRSV感染诱导还是TRIM28输出的结果的问题。

TRIM家族成员可以直接或通过激活先天免疫反应限制病毒复制。相反，病毒可能编码拮抗剂来规避TRIM蛋白，从而增强病毒复制。TRIM28长期以来被认为是转录抑制因子，其抑制基因表达的作用对病毒转录和复制具有深远影响。累积证据表明TRIM28有效抑制各种疱疹病毒的转录，包括KSHV、HCMV和EBV。

总之，本研究阐明PRRSV感染通过TRIM28从核向质的转位诱导自噬，在胞质中与VPS34和Beclin1形成复合物。此外，PRRSV Nsp4被确定为通过CRM1依赖途径促进TRIM28核输出的关键因子。作为尼多病毒目动脉炎病毒科成员，PRRSV是PRRS的主要致病因子，对兽医学构成重大挑战。本研究首次详细阐述了PRRSV介导自噬的机制，为了解PRRS及其他尼多病毒目成员（如SARS-CoV-2、猪流行性腹泻病毒和传染性支气管炎病毒）的发病机制提供了宝贵见解。