丙型肝炎病毒NS3/4A蛋白酶通过切割脂滴周转关键调控因子SPG20促进脂滴形成

本研究发现丙型肝炎病毒（HCV）通过其NS3/4A蛋白酶特异性切割宿主脂滴（LD）周转关键调控因子SPG20（Spartin），揭示了HCV诱导肝细胞中大脂滴形成的新机制。SPG20切割破坏了其与脂滴表面蛋白TIP47的相互作用，抑制了E3泛素连接酶Itch向脂滴的招募，从而阻断了脂滴相关蛋白ADRP的泛素化降解途径。ADRP的积累保护脂滴免受脂肪酶介导的降解，最终促进大脂滴形成。该研究为HCV感染相关肝脂肪变性的分子机制提供了重要见解，为开发靶向脂代谢的抗病毒策略奠定了理论基础。

　　

ABSTRACT

丙型肝炎病毒（HCV）的组装过程紧密关联脂滴（LDs），后者在HCV RNA复制中扮演重要角色。HCV感染常导致肝细胞内大型LDs的积聚，但其分子机制尚未明确。已知SPG20/Spartin蛋白通过招募泛素连接酶Itch促进脂滴保护蛋白adipophilin（ADRP）的泛素化降解，从而调控LDs的周转。为阐明HCV诱导大脂滴形成的机制，本研究探讨了SPG20蛋白在HCV J6/JFH1感染的Huh-7.5细胞中的作用。免疫印迹分析显示，HCV感染促进了SPG20蛋白的切割；递增转染NS3/4A（而非其失活突变体）导致SPG20切割，表明NS3/4A蛋白酶参与此过程。定点突变实验提示，NS3/4A蛋白酶在Cys⁵⁰⁴和Cys⁵⁶²位点切割SPG20。SPG20与LD附着蛋白TIP47发生共免疫沉淀，而递增NS3/4A（非失活突变体）降低了SPG20与TIP47的共沉淀。在Huh-7.5细胞中，Itch的siRNA敲低恢复了ADRP水平，表明Itch介导了ADRP的泛素化降解。HCV感染细胞的免疫荧光染色显示，ADRP主要定位于LDs周围，而胞质ADRP减少。本研究提出，HCV NS3/4A蛋白酶特异性切割SPG20，抑制Itch介导的LD相关ADRP的泛素化降解，从而促进大LDs的形成。

HCV感染增大脂滴尺寸而非数量

通过BODIPY脂质探针进行免疫荧光染色，发现HCV J6/JFH1感染的Huh-7.5细胞中的LDs比模拟感染细胞更大。使用NS3/4A蛋白酶抑制剂VX950处理细胞后，LD表面积减少，表明HCV感染增加了LD表面积。ImageJ软件测量显示，HCV感染细胞的LDs具有更大的表面积和直径，而VX950处理减少了这些参数。LDs计数表明，HCV感染并未增加每个细胞的LD数量，提示HCV感染特异性地增大LDs尺寸而非数量。

HCV NS3/4A蛋白酶负责SPG20的切割

免疫印迹分析显示，HCV感染促进了SPG20蛋白的切割，切割形式在感染后3、5、7天被检测到。转染实验表明，HCV NS2蛋白酶不参与SPG20切割，而递增NS3/4A（非失活突变体）导致SPG20切割。共免疫沉淀证实NS3/4A与SPG20相互作用，且切割依赖于NS3/4A的蛋白酶活性。使用NS3/4A抑制剂VX950或TMC435（而非NS5A抑制剂DCV）处理，可抑制外源SPG20的切割，进一步证实NS3/4A蛋白酶活性是SPG20切割所必需的。

NS3/4A蛋白酶在Cys⁵⁰⁴和Cys⁵⁶²位点切割SPG20

基于NS3/4A蛋白酶切割位点的共识序列，SPG20上存在四个潜在切割位点。通过C端FLAG标签的SPG20构建体，免疫沉淀检测到NS3/4A依赖的约22 kDa和19 kDa切割片段。点突变实验显示，C504A突变减少22 kDa片段，C562A突变减少19 kDa片段，而C499A和T587A突变不影响切割。双突变C504A/C562A完全消除切割，表明NS3/4A蛋白酶在Cys⁵⁰⁴和Cys⁵⁶²位点切割SPG20。

泛素连接酶Itch介导ADRP的多泛素化

HCV感染增加Itch在Thr222位的磷酸化，表明JNK激活导致Itch激活。细胞泛素化实验显示，过表达Itch（而非WWP1或WWP2）促进ADRP的多泛素化。Itch的siRNA敲低或失活突变体Itch C868A表达抑制ADRP泛素化。共免疫沉淀证实Itch与ADRP直接相互作用，表明Itch特异性地介导Huh-7.5细胞中ADRP的泛素化降解。

HCV感染诱导ADRP的泛素依赖性蛋白酶体降解

免疫印迹显示，HCV感染细胞中ADRP蛋白水平显著降低，而TIP47水平不变。蛋白酶体抑制剂MG132处理恢复ADRP水平，表明HCV感染通过泛素-蛋白酶体途径促进ADRP降解。Itch的siRNA敲低恢复HCV感染细胞中的ADRP水平，证实Itch介导此过程。NS3/4A抑制剂VX950或NS5A抑制剂DCV处理也恢复ADRP水平，表明HCV感染诱导ADRP降解。

ADRP在HCV感染细胞中积累于脂滴周围

免疫荧光染色显示，模拟感染细胞中ADRP分布于胞质，而HCV感染细胞中ADRP主要定位于LDs表面，表明HCV感染促进ADRP在LDs表面的积累。

NS3/4A蛋白酶切割SPG20并抑制SPG20–TIP47相互作用

SPG20与TIP47的相互作用区域（aa 433–584）包含NS3/4A切割位点Cys⁵⁰⁴和Cys⁵⁶²。共免疫沉淀证实SPG20与TIP47在Huh-7.5细胞中相互作用。NS3/4A表达抑制SPG20与TIP47的共沉淀，而失活突变体无此效应。内源TIP47与SPG20的相互作用在NS3/4A存在时被抑制。HCV感染抑制SPG20–TIP47相互作用，而SPG20 C504A突变体恢复此相互作用，表明NS3/4A切割SPG20破坏其与TIP47的结合。

讨论

LDs在HCV复制和病毒粒子产生中起关键作用。本研究揭示HCV NS3/4A蛋白酶切割SPG20，破坏SPG20–TIP47相互作用，从而抑制Itch向LDs的招募，阻止LD相关ADRP的泛素化降解。ADRP的积累保护LDs免受脂肪酶介导的降解，导致大LDs形成。NS3蛋白定位于LDs表面，支持NS3/4A切割LD相关蛋白SPG20的合理性。ADRP在LD生物发生中作用重要，SPG20作为脂噬受体调控LD周转。Itch通过JNK激活被磷酸化并激活，促进底物泛素化。HCV感染降低ADRP蛋白水平，MG132处理可恢复，表明泛素-蛋白酶体途径参与此过程。HCV感染细胞中ADRP定位于LDs表面，而胞质ADRP减少，可能与Itch激活促进胞质ADRP降解有关。不同HCV基因型中，基因3型与肝脂肪变性最强相关，未来需研究NS3/4A介导机制与HCV核心蛋白机制的互作。其他黄病毒如登革病毒和寨卡病毒也利用LDs复制，未来可探索SPG20、ADRP、Itch和JNK在这些病毒感染中的作用。总之，本研究提出HCV NS3/4A蛋白酶切割SPG20，抑制SPG20–TIP47相互作用，阻止LD相关ADRP降解，促进大LDs形成的新机制，为HCV感染相关脂肪变性和慢性肝病的治疗提供新见解。