H5N1高致病性禽流感病毒血凝素蛋白在禽类和哺乳动物组织中的附着模式比较：揭示分支1与2.3.4.4b的保守性

本研究通过生物层干涉技术(BLI)和蛋白组织化学方法，系统比较了H5N1高致病性禽流感病毒(HPAI)分支1与当前流行分支2.3.4.4b的血凝素(HA)蛋白受体结合特性。研究发现尽管存在氨基酸差异，两类HA蛋白均优先结合α2,3-连接唾液苷(3′SLN)，且对乳牛乳腺组织及多物种呼吸道组织表现出相似附着模式，表明当前乳牛疫情暴发更可能与生态因素而非HA受体结合特异性改变相关。

　　

ABSTRACT

全球传播的A/goose/Guangdong/1/96系H5N1高致病性禽流感(HPAI)病毒伴随着宿主范围的扩大和在乳牛中建立持续病毒传播。为评估进化中的H5N1病毒是否随时间改变组织嗜性，研究人员比较了源自分支1(A/Vietnam/1203/04, H5VN)和当前流行分支2.3.4.4b病毒的重组血凝素(HA)蛋白的结合模式，这些病毒分别来自野生鸟类(A/Eurasian Teal/Hong Kong/AFCD-HKU-23-14009-01020/2023, H5HK)和乳牛(A/bovine/Ohio/B24OSU-439/2024, H5OH)。A(H1N1)pdm09病毒的HA蛋白被纳入作为对照。

使用生物层干涉技术(BLI)，H1蛋白优先结合α2,6-连接唾液苷6′SLNLN，而H5蛋白优先结合α2,3-连接唾液苷3′SLN。H5OH对3′SLN的结合亲和力高于H5HK和H5VN。研究人员评估了H1和H5蛋白对不同物种呼吸道组织和乳牛乳腺的附着模式。与H1蛋白相比，H5蛋白对猫、牛、鸡、雪貂、人和猪的肺上皮细胞显示出更强结合，且分支2.3.4.4b H5蛋白表现出对猪和牛支气管上皮细胞的结合增强。所有H5蛋白都附着于乳腺中的肺泡和乳池上皮细胞，其中分别通过^{Maackia amurensis}凝集素II和^{Sambucus nigra}凝集素检测到α2,3-连接和α2,6-连接的唾液酸聚糖。总而言之，分支1和2.3.4.4b H5N1病毒的HA蛋白总体上对禽类和哺乳动物组织具有相似的附着模式，尽管在过去30年里进化成了抗原性不同的分支。

IMPORTANCE

自2024年以来H5N1高致病性禽流感(HPAI)病毒在美国乳牛中的暴发引起了人们对HA受体结合特异性和组织嗜性潜在变化的担忧。使用源自分支1和当前流行分支2.3.4.4b H5N1病毒的昆虫细胞表达重组HA蛋白，研究人员表明乳牛H5蛋白保留了对类禽α2,3-连接唾液苷3′SLN的结合特异性，而非类人α2,6-连接唾液苷6′SLNLN，且对3′SLN的结合亲和力高于其他H5蛋白。分支1和2.3.4.4b H5蛋白对泌乳乳牛的乳腺组织显示出相似的附着模式，这些组织高表达α2,3-连接和α2,6-连接的唾液酸聚糖。所有H5蛋白也对猫、牛、鸡、雪貂、人和猪的肺部显示出相似的附着模式。研究结果表明，近期乳牛中的H5N1暴发可能与生态因素而非HA受体结合特异性的改变有关。

INTRODUCTION

自从三十年前中国南方出现A/goose/Guangdong/1/96 (Gs/Gd)系H5N1高致病性禽流感病毒(HPAI)以来，血凝素(HA)蛋白已进化成多个抗原性不同的分支，并且Gs/Gd样病毒通过候鸟传播到各大洲。自2020年以来，分支2.3.4.4b H5N1病毒的出现和地理分布扩大伴随着家养和野生鸟类物种中疫情暴发数量的增加，在人类和多种哺乳动物物种中的溢出感染，以及在乳牛（甲型流感病毒的新哺乳动物宿主）中建立持续病毒传播。

自2024年3月以来，美国多个州报告了乳牛中基因型B3.13分支2.3.4.4b H5N1病毒的疫情。感染牛表现出食欲不振、产奶量大幅下降和轻微的呼吸道症状。实地研究检测到感染乳牛奶液和乳腺中的病毒载量高于鼻拭子或肺部检测到的病毒载量。使用鼻内或乳腺内接种途径的实验研究也证明了病毒在乳腺中的复制优先于呼吸道组织。重要的是，用欧洲野鹅分离的遗传学 distinct 分支2.3.4.4b病毒（基因型euDG）进行乳腺内接种的乳牛表现出与接种基因型B3.13乳牛分离株相当的临床症状，这表明感染乳牛的能力可能在分支2.3.4.4b H5N1病毒中共享，这一发现得到了2025年1月在乳牛中检测到分支2.3.4.4b基因型D1.1的支持。这些发现表明，乳牛中的H5N1疫情可能归因于病毒学因素（例如，在乳牛乳腺组织中复制的能力）和生态因素（例如，共享挤奶设备和州际牛只移动）。然而，尚不清楚早期的Gs/Gd系H5N1病毒是否也具有感染乳牛的能力。

HA蛋白的受体结合谱决定了甲型流感病毒的宿主范围和细胞嗜性。禽流感病毒的HA蛋白优先结合α2,3-连接的唾液酸聚糖，而人类和猪流感病毒的HA蛋白优先结合α2,6-连接的唾液酸聚糖。在此，研究人员使用昆虫细胞表达的重组HA蛋白，比较了分支1和2.3.4.4b病毒对乳牛乳腺组织以及猫、牛、鸡、雪貂、人和猪的呼吸道组织的HA附着模式。

RESULTS

通过生物层干涉测定法检测昆虫细胞表达的重组HA蛋白与Neu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβ-sp3-PAA-biot (3′SLN)和Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-sp3-PAA-biot (6′SLNLN)的结合亲和力

为了比较过去和当前流行H5N1病毒的HA蛋白附着模式，研究人员表达了A/Vietnam/1203/2004（分支1，缩写为H5VN）、A/Eurasian Teal/Hong Kong/AFCD-HKU-23-14009-01020/2023（分支2.3.4.4b，缩写为H5HK）和A/bovine/Ohio/B24OSU-439/2024（分支2.3.4.4b，缩写为H5OH）的HA蛋白。作为比较，也表达了来自A/California/04/2009 A(H1N1)pdm09病毒（H1CA）的HA蛋白。使用生物层干涉技术(BLI)评估表达的HA蛋白对3′SLN和6′SLNLN的结合亲和力。所有H5蛋白表现出优先结合3′SLN而非6′SLNLN，而H1CA表现出优先结合6′SLNLN而非3′SLN。使用连续两倍稀释的HA蛋白（从200到6.25 nM）进行进一步分析以确定结合亲和力，研究人员观察到H5OH表现出比H5VN和H5HK更高的结合亲和力（平均K_D ± SD = 18.55 ± 1.35 nM）（单向方差分析[ANOVA]，^P < 0.01）。虽然分支1 H5VN与分支2.3.4.4b H5OH相差40个氨基酸，但两个分支2.3.4.4b H5HK和H5OH在HA1中仅相差四个氨基酸（L111M, L122Q, T199I, V214A, H3编号）。具体来说，T199I变化已被报道可增加HA对乳牛疫情中报道的首例人类H5N1分离株(A/Texas/37/2024)的α2,3-连接^N-乙酰乳糖胺的结合广度。

分支1和分支2.3.4.4b H5蛋白结合泌乳奶牛的乳腺组织

乳腺组织感染是分支2.3.4.4b H5N1在乳牛中暴发观察到的一个独特特征。研究人员比较了H5VN、H5HK、H5OH和H1CA对泌乳奶牛乳腺组织的附着模式。使用稀释至12.5 μg/mL的重组蛋白，研究人员未观察到H1CA的结合，但所有三种H5重组蛋白对肺泡和乳池上皮细胞显示出相当的结合强度。值得注意的是，未观察到对导管上皮细胞的结合。为了进一步表征乳腺组织中存在的α2,3和α2,6-连接唾液酸聚糖，研究人员进行了凝集素染色，使用优先结合NeuAcα2,6Galβ1,4GlcNAc的^{Sambucus nigra}凝集素(SNA)、优先结合N-聚糖或O-聚糖中NeuAcα2,3Galβ1,4GlcNAc的^{Maackia amurensis}凝集素I (MAL-I)，以及优先结合O-聚糖中NeuAcα2,3Galβ1,3GalNAc的MAL-II。SNA和MAL-II均显示出明显的肺泡上皮细胞结合和轻微的乳池上皮细胞结合。有趣的是，未观察到明显的MAL-I结合，表明泌乳奶牛的乳腺组织可能低表达NeuAcα2,3Galβ1,4GlcNAc。

H5蛋白对鸡、猫、牛、雪貂、人和猪的肺上皮细胞表现出强结合

研究人员进一步评估了重组HA蛋白对不同物种呼吸道组织的附着模式。所有H5蛋白结合鸡气管和肺上皮细胞，而未观察到H1CA的结合。重组HA蛋白也对哺乳动物呼吸道组织表现出不同的附着模式。在雪貂支气管中，H1CA对支气管上皮细胞显示出斑片状但更高的整体结合信号 than the H5 proteins，而分支2.3.4.4b H5蛋白对猪和牛支气管显示出比H1CA更强的结合。所有三种H5重组蛋白对猫、牛、人和猪的肺上皮细胞显示出比H1蛋白更强的结合，其中H5OH对雪貂肺上皮细胞的结合强于H5HK或H5VN。先前的研究报道H5N1和禽流感病毒通常比人类季节性流感病毒对各种物种的肺组织表现出更强的附着。总而言之，结果表明源自分支1和分支2.3.4.4b H5N1病毒的HA蛋白对不同物种呼吸道组织的附着模式存在微小差异。

DISCUSSION

分支2.3.4.4b H5N1病毒宿主范围的扩大和在乳牛中的持续传播引起了人们对HA对动物组织上表达的唾液酸聚糖附着模式潜在变化的担忧，这可能影响病毒传播性和大流行潜力。先前的研究表明，乳牛病毒表现出对α2-3-连接唾液苷的优先结合和组织嗜性，类似于禽流感病毒，包括早期的Gs/GD系H5Nx毒株。与我们的研究设计类似，两项先前的研究使用源自分支1、分支2.1.2.3和2.3.4.4b H5Nx病毒的哺乳动物或昆虫细胞表达重组HA蛋白来评估HA对牛（气管、细支气管、肺、乳腺、结膜）、马（气管和肺）、猪（气管和肺）和人（气管、细支气管、肺、乳腺、结膜）组织的附着模式，并得出相似发现。虽然我们的结果与这两项研究一致，但我们额外展示了分支1和分支2.3.4.4b H5蛋白对猫和雪貂肺组织以及牛、雪貂和猪支气管组织的结合模式。我们还观察到分支2.3.4.4b H5蛋白对猪和牛支气管上皮细胞的结合增加 than the H1 protein，表明猪可能易感分支2.3.4.4b病毒感染，并且进一步与其他猪流感病毒共感染可能带来出现新型重配病毒的风险。考虑到迄今为止的可用文献，结果表明源自过去和当前流行的分支2.3.4.4b H5Nx病毒的H5蛋白通常对牛乳腺组织和不同宿主的呼吸道组织具有相当的附着模式。这表明乳牛中的H5N1疫情可能与生态因素而非HA受体结合特异性的改变有关。需要额外的流行病学研究和环境采样来确定与H5N1传入奶牛群相关的风险因素。

使用BLI，研究人员观察到所有H5蛋白优先结合3′SLN，未检测到对6′SLNLN的结合。H5OH也显示出比H5HK或HKVN更高的对3′SLN的结合亲和力。BLI测定灵敏且定量，但每次仅允许评估HA对特定聚糖的结合。另一方面，使用重组HA蛋白可以评估在呈现多种聚糖结构的组织中的病毒嗜性，尽管这种方法比定量更定性。有趣的是，虽然H5VN对3′SLN的结合低于H5OH，但H5VN似乎对各种动物组织显示出与H5OH相似的附着模式。与我们的发现一致，聚糖阵列分析显示H5VN对3′SLN的结合减少 than the分支2.3.4.4b A/Texas/37/2024病毒（具有与H5OH相同的HA序列）。另一项研究也显示H5VN exhibited different binding patterns than the HA of A/bovine/Ohio/B24OSU-432/2024（具有与H5OH相同的HA序列）对双触角N-聚糖和O-聚糖。总的来说，这些发现证明了不同实验方法的优势以及在评估HA结合特异性和组织嗜性时需要考虑不同平台。

实验感染表明，乳腺可能作为分支2.3.4.4b H5N1病毒在乳牛中的主要复制部位。由于分支1和分支2.3.4.4b H5蛋白都结合乳腺中的肺泡和乳池上皮细胞，只要有适当的机会，分支1 H5N1病毒可能类似地引起乳腺组织感染。H5蛋白在乳腺中的附着模式与先前研究报道的结果一致。使用凝集素染色，研究人员观察到在泌乳奶牛乳腺组织中主要表达NeuAcα2,6Galβ1,4GlcNAc（由SNA检测）和NeuAcα2,3Galβ1,3GalNAc（由MAL-II检测），而NeuAcα2,3Galβ1,4GlcNAc（由MAL-I检测）的表达较低。这一结果，结合H5蛋白附着模式，表明H5蛋白结合乳腺组织中的NeuAcα2,3Galβ1,3GalNAc O-聚糖。有趣的是，尽管α2,6-连接的唾液酸聚糖沿腺泡肺泡和乳池上皮细胞分布，但研究人员未观察到H1蛋白对这些组织的任何结合。我们的结果与先前报道的一致，包括小鼠适应流感株A/Puerto Rico/8/34衍生的重组H1蛋白对乳牛乳腺组织的有限附着，以及A(H1N1)pdm09病毒在牛乳腺组织^{ex vivo}培养中的受限复制。

我们研究的主要局限性在于，仅凭HA附着模式不足以推断病毒在这些动物组织中的复制效率，因为病毒复制还取决于病毒基因组合和宿主适应性氨基酸变化。随着当前流行的分支2.3.4.4b病毒通过与其他禽流感病毒的频繁基因重配继续扩大其遗传多样性，遗传多样的分支2.3.4.4b病毒在不同宿主物种中的复制效率需要进一步通过实验验证。在相当的病毒聚合酶活性下，Bauer等人证明了一个分支2.3.4.4b病毒比一个分支2.1.3.2病毒在人类鼻和气管/细支气管上皮细胞中表现出更好的附着和更有效的复制。使用重组HA蛋白，Carrasco等人和Song等人也报道分支2.3.4.4b病毒比分支2.1.3.2病毒更易附着于人类气管上皮细胞。

总而言之，迄今为止的数据支持分支2.3.4.4b保留了与早期H5N1病毒相当的受体结合谱。然而，重要的是要注意H5N1病毒继续在哺乳动物中引起溢出感染，这为病毒适应提供了机会。一项研究报道，单个Gln226Leu突变可能将牛H5N1病毒的结合特异性转换为人型受体。持续监测和监控来自不同宿主物种的H5N1病毒进化对于大流行防范至关重要。

MATERIALS AND METHODS

重组HA蛋白的表达

可溶性重组HA蛋白按照既定方案表达和纯化。编码A(H1N1)pdm09和A(H5N1)（去除多碱性裂解位点）病毒HA蛋白胞外域的基因被亚克隆到杆状病毒转移载体pFastBac1中，与N端gp67信号肽、C端来自T4噬菌体的三聚化foldon序列、随后是凝血酶切割位点和His₆-标签框内融合。使用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统在Sf9细胞中进行转染和杆状病毒扩增。感染后第3天，收获上清液，并使用镍 charged 固定化金属亲和色谱树脂纯化HA蛋白。重组蛋白分装保存在含20%蔗糖的PBS中，储存于?80°C。

使用生物层干涉技术检测HA与聚糖的结合亲和力

使用生物层干涉技术(BLI)评估表达的重组HA蛋白与生物素化3′SLN和生物素化6′SLNLN的结合亲和力。测定使用Octet Red96e系统在96孔微孔板中进行。使用含钙、镁和0.005% Tween-20的Dulbecco's PBS作为测定缓冲液来重构蛋白和聚糖分子。将生物素化3′SLN和6′SLNLN以1 μg/mL预加载到链霉亲和素包被的生物传感器上10分钟。将稀释至67.5 nM的HA蛋白与小鼠抗His标签抗体和辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗小鼠二抗以摩尔比2:1:2在冰上预孵育30分钟，然后加入孔中。将96孔板在30°C孵育30分钟，样品板以1000 RPM振荡。在HA浓度为6.25、12.5、25、50、100和200 nM下，测量H5蛋白与3′SLN的结合动力学20分钟。数据用1:1结合模型拟合以评估HA对3′SLN的结合亲和力(K_D)。

重组HA蛋白的免疫组织化学染色

福尔马林固定石蜡包埋的组织块和切片由香港大学李嘉诚医学院病理学系制备或从合作实验室获得。按照先前描述的方案进行免疫组织化学，略有修改。简而言之，切片在60°C干燥20分钟，脱蜡并水化。通过在10 mM柠檬酸钠(pH 6.0)中煮沸切片20分钟实现抗原修复。使用3%过氧化氢淬灭内源性过氧化物酶活性，并使用10%山羊血清封闭非特异性结合。将组氨酸标记的重组HA蛋白稀释至12.5 μg/mL，并按描述与小鼠抗His标签一抗和HRP标记的山羊抗小鼠二抗预孵育。然后将这种预复合混合物应用于组织切片，在室温下孵育2小时，随后用含0.05% Tween-20 (vol/vol)的PBS缓冲液(PBST)洗涤。使用色原3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)作为HRP底物。组织用Gill's苏木精复染，用永久性水性封片剂封片，并使用Nikon Eclipse Ti-S显微镜检查。实验独立重复两次。

凝集素染色

为了评估组织切片中α2,3-连接和α2,6-连接的唾液酸聚糖的分布，使用生物素化^{Sambucus nigra}凝集素(SNA)、^{Maackia amurensis}凝集素I (MAL-I)和^{Maackia amurensis}凝集素II (MAL-II)进行染色。SNA已知优先结合α2,6-连接末端唾液酸(SA) (Neu5Acα2,6Galβ1,4GlcNAc)。MAL-I和MAL-II优先结合α2,3-连接末端SA，但MAL-I偏好Neu5Acα2,3Galβ1,4GlcNAc，而MAL-II偏好Neu5Acα2,3Galβ1,3GalNAc。按上述进行抗原修复和内源性过氧化物酶封闭。用0.1%牛血清白蛋白封闭后，将载玻片与20 μg/mL SNA/MAL-I或10 μg/mL MAL-II在室温下孵育1小时，随后与碱性磷酸酶标记的链霉亲和素孵育45分钟。然后使用Vector Red底物试剂盒显色。用Gill's苏木精复染后，载玻片用Scott's自来水复染，风干，并用Permount封片。

统计分析

为了比较HA对呼吸道和乳腺组织的结合强度，使用Qupath软件从两个独立染色的组织切片中对色原AEC信号进行量化。使用单向ANOVA检验比较不同重组HA蛋白的结合信号。

ACKNOWLEDGMENTS

本研究由美国国立卫生研究院NIAID（合同号75N93021C00016）和中国香港特别行政区研资局主题研究计划（T11-712/19-N）支持。

感谢Richard Webby博士分享A/bovine/Ohio/B24OSU-439/2024的HA序列。