LPS/TLR4激活的M1极化巨噬细胞来源外泌体增强鸡传染性支气管炎疫苗免疫保护效能的机制研究

本研究首次系统评估了LPS激活的M1极化鸡巨噬细胞来源外泌体（HD11M1-exo）作为新型佐剂对鸡传染性支气管炎病毒（IBV）疫苗的免疫增强作用。通过体外、鸡胚和体内多模型验证，发现HD11M1-exo可通过激活LPS/TLR4信号通路显著增强巨噬细胞吞噬功能，上调关键细胞因子（IL-1β、IL-2、IL-4、IFN-γ、TNF-α）表达，促进黏膜免疫（sIgA）和体液免疫（IgY）应答，在提高H120疫苗交叉保护效果的同时显著降低病理损伤，为禽类呼吸道疾病疫苗佐剂开发提供了新策略。

　　

外泌体的分离与表征研究

通过脂多糖（LPS）刺激鸡巨噬细胞系HD11，成功诱导其向M1表型极化，表现为诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、白细胞介素-6（IL-6）、IL-12、IL-23及共刺激分子CD80/CD86的mRNA表达显著上调。采用超速离心法从培养上清中分离获得M1型巨噬细胞来源外泌体（HD11_M1-exo），透射电镜显示其呈典型杯状或球形形态，粒径主要分布于30–200 nm范围内，Western blot检测证实外泌体标志蛋白HSP70和ALIX的表达，符合外泌体生物学特征。

HD11_M1-exo通过LPS/TLR4通路增强巨噬细胞免疫活性

体外实验表明，HD11_M1-exo处理可显著提高巨噬细胞对中性红的吞噬能力。在分子机制层面，qPCR与Western blot分析显示，HD11_M1-exo激活LPS/TLR4信号通路，关键基因CD14、TLR4、TRAM、TRAF3、IRF3和CD80的mRNA及蛋白表达均显著上调。该过程涉及TLR4受体识别外泌体所携带的配体，通过髓样分化因子88（MyD88）和非MyD88依赖的TRIF通路双重激活下游免疫应答。

HD11_M1-exo预处理增强鸡胚对IBV感染的抵抗能力

在18日龄鸡胚模型中，预先注射HD11_M1-exo再进行IBV攻毒，可显著减轻病毒感染引起的病理损伤。qPCR分析显示，处理组鸡胚气管组织中TNF-α、TLR4、IL-2、IL-4、IL-1β和IFN-γ等细胞因子在不同时间点（24 h、48 h、72 h）表达显著上调，表明HD11_M1-exo通过调节先天免疫应答增强抗病毒能力。

HD11_M1-exo增强鸡体细胞与黏膜免疫应答

在鸡体实验中，HD11_M1-ex滴注处理可显著提高气管和哈德氏腺中CD80与CD86的转录水平，证实其增强T细胞共刺激信号的能力。同时，黏膜免疫相关因子TGF-β4的mRNA表达及泪液中分泌型免疫球蛋白A（sIgA）浓度均显著上升，说明HD11_M1-exo对呼吸道局部免疫具有明显促进作用。

HD11_M1-exo作为疫苗佐剂提升H120免疫效果

将HD11_M1-exo与IBV弱毒疫苗H120联合使用，可显著增强疫苗诱导的细胞免疫、体液免疫及黏膜免疫应答。与商品佐剂（铝佐剂和Montanide IMS 1313）相比，HD11_M1-exo佐剂组在血清IgY抗体效价、泪液sIgA水平及气管CD80/CD86表达方面均表现更优，尤其在14天和28天时免疫增强效果最为显著。

HD11_M1-exo佐剂改善疫苗对异源毒株的交叉保护

使用IBV HX强毒株进行攻毒实验，结果显示HD11_M1-exo+H120免疫组鸡只气管病毒载量显著降低，病理损伤明显减轻，体重下降得到有效抑制。组织病理学分析进一步证实，该组鸡只气管纤毛脱落、上皮细胞坏死及淋巴细胞浸润程度均较其他组别轻微，表明HD11_M1-exo可增强H120疫苗对异源毒株的交叉保护能力。

讨论与展望

本研究首次在细胞、鸡胚和动物水平系统验证了M1巨噬细胞来源外泌体作为免疫佐剂的潜力。其作用机制涉及TLR4/NF-κB信号通路的激活、关键细胞因子的上调表达以及黏膜—体液—细胞免疫的多重增强效应。这些发现不仅为禽类疫苗佐剂研发提供了新思路，也为抗IBV及其他禽呼吸道病原的免疫策略制定奠定了理论基础。未来研究可进一步探索HD11_M1-exo的组分特征及其与抗原递呈系统的协同机制。