RALF1通过协同内吞途径诱导AHA2内化与液泡降解的时空动态机制解析

本研究针对植物如何响应RALF1肽信号调控质膜H+-ATPase AHA2的活性与稳态这一关键问题，通过单粒子追踪与可变角全内反射荧光显微技术，首次揭示RALF1通过激活网格蛋白介导的内吞(CME)与非网格蛋白内吞(CIE)协同途径，促进AHA2的内化与液泡降解，阐明了磷酸化修饰调控AHA2时空动态的分子机制，为植物环境适应与信号转导研究提供了新范式。

　　

植物细胞通过精确调控质膜质子泵（H⁺-ATPase）的活性来维持胞内外pH稳态，从而驱动养分吸收、细胞扩张和逆境响应等关键生理过程。拟南芥中的AHA2作为重要的质膜H⁺-ATPase家族成员，其活性受到快速碱化因子RALF1肽的抑制，但RALF1如何调控AHA2的膜动态及最终命运尚不明确。传统研究多聚焦于磷酸化对酶活性的直接调控，而对蛋白亚细胞定位、内吞途径及降解机制的时空动态缺乏深入解析。

为解决上述问题，北京林业大学林金星和李小娟团队在《Plant Communications》发表了最新研究成果。研究人员通过整合单粒子追踪技术（SPT）、可变角全内反射荧光显微镜（VA-TIRFM）、荧光相关光谱（FCS）及双色荧光互相关光谱（FCCS）等前沿活细胞成像技术，结合分子遗传学、药理学和生化分析，系统解析了RALF1调控AHA2膜动态、内吞途径与降解命运的分子机制。

研究首先通过表型分析发现aha2突变体对RALF1介导的根生长抑制表现出耐受性，证实AHA2是RALF1信号通路的关键组分。利用功能互补的GFP-AHA2转基因材料，研究人员通过单粒子追踪技术首次量化了AHA2在质膜上的运动特征：正常条件下AHA2呈现两种运动模式（短距离扩散0.21±0.02μm与长距离运动0.42±0.04μm）。RALF1处理显著降低了AHA2的运动速度（从0.97μm/s降至0.83μm/s），并促进其形成膜簇结构，暗示蛋白聚集与内化启动。

通过内吞标记FM4-64共定位、布雷菲德菌素A（BFA）处理及细胞器标记融合实验，研究证明RALF1诱导AHA2从质膜内化，经反式高尔基体网络/早期内体（TGN/EE）转运至多囊体（MVB）并最终进入液泡降解。Western blot结果显示RALF1处理3小时后AHA2蛋白水平显著下降，且此过程依赖于蛋白酶体途径抑制剂Conc A敏感的液泡降解机制。

关键突破在于揭示了AHA2内吞的双重途径调控机制。药理学实验（TyrA23抑制CME、MβCD破坏膜微结构）与遗传学证据（诱导型HUB片段抑制clathrin功能、smt2smt3固醇合成突变体破坏CIE）共同证实：稳态下AHA2主要通过CIE途径内化；而RALF1刺激同时激活CME与CIE途径，协同促进AHA2的内吞。双色TIRF-SIM成像与FCCS分析显示，RALF1显著增强AHA2与clathrin轻链（CLC）及脂筏标记蛋白Flot1的共定位与互作强度。

研究进一步通过磷酸化位点突变体（S931A模拟去磷酸化、S931D模拟磷酸化）阐明磷酸化状态对AHA2动态的调控：S931D突变体表现出与RALF1处理相似的慢扩散、高内化特征，证实磷酸化直接调控AHA2的膜动态与内吞效率。

该研究首次绘制了RALF1-AHA2信号模块的时空动态图谱，揭示植物通过协同激活CME与CIE双重内吞途径精密调控质子泵稳态的新机制，为理解肽激素调控膜蛋白运输提供了范式。研究成果对作物抗逆调控、细胞信号转导及膜蛋白动态研究具有重要理论意义与应用价值。