黄素依赖单加氧酶HlMO18-2调控啤酒花腺毛中(6S)-α-苦味酸立体选择性生物合成

为解决啤酒花中关键苦味物质α-酸生物合成最后一步氧化反应的酶学机制问题，研究人员通过酵母异源表达系统结合手性色谱技术，发现黄素依赖单加氧酶HlMO18-2（HS1）特异性催化(6S)-α-苦味酸形成，其与异戊烯基转移酶HlPT1L的互作揭示了代谢通道化机制，为啤酒风味品质改良提供了关键酶学基础。

　　

在啤酒酿造工业中，啤酒花（Humulus lupulus L.）雌花球果上的腺毛是高度特化的代谢工厂，积累着决定啤酒品质的特殊代谢产物。其中，α-酸（包括葎草酮、合葎草酮和加葎草酮）作为啤酒苦味的核心成分，被誉为啤酒的"灵魂"。这些异戊二烯化聚酮化合物在麦汁煮沸过程中发生热异构化，生成异-α-酸，成为啤酒苦味的主要来源。尽管α-酸的生物合成途径前期研究已阐明关键步骤——包括支链氨基酸（BCAAs）来源的酰基辅酶A前体、MEP途径提供的C5异戊烯二磷酸、以及由羧基辅酶A连接酶（HlCCL2/4）、缬草酮合酶（HIVPS）和异戊烯基转移酶复合体（HlPT1L/HlPT2）催化的系列反应，但将脱氧-α-酸（DD-酰基间苯三酚）转化为α-酸的最后氧化步骤的酶学机制仍不明确。更值得注意的是，α-酸分子中第六位碳原子是一个手性中心，天然产物中主要存在(6S)-构型，这种立体选择性形成的机制成为领域内亟待解决的科学问题。

研究人员通过酵母异源表达系统、分子对接、膜酵母双杂交（MbY2H）和亚细胞定位等关键技术，结合啤酒花不同组织转录组分析和手性液相色谱-质谱联用（LC-MS）分析，系统解析了(6S)-α-苦味酸生物合成的酶学机制。

研究首先通过化学合成脱氧-α-酸底物，发现其在溶液中可自发氧化生成外消旋的α-酸混合物，但天然啤酒花腺毛中主要积累(6S)-构型产物，提示存在酶促立体选择性催化。通过对啤酒花腺毛转录组数据库（TrichOME）筛选，获得19个单加氧酶候选基因，其中4个（MO1、MO3、MO11和MO18）显示腺毛特异性表达模式。值得注意的是，MO18存在两个变异体：HlMO18-1和HlMO18-2，后者在149-154位缺失六个氨基酸（R149NENYF154），这两个序列与已报道的HS1（KJ398144.1）和HS2（KJ398145.1）高度同源。

通过酵母工程菌株表达系统研究发现，仅HlMO18-2能显著提高(6S)-/(6R)-葎草酮比例至7.96:1，而其他候选基因无此功能。HlMO18-1活性明显弱于HlMO18-2，表明其额外的六个氨基酸对酶活性有抑制作用。N端预测的叶绿体转运肽截断实验显示，该区域对维持全酶功能至关重要。研究人员进一步验证了公共数据库中的HS1和HS2功能，发现HS2无(6S)-葎草酮合酶活性，推测其来源于低α-酸品种"Teamaker"，而HS1（即HlMO18-2）具有显著活性。通过低氧培养和添加抗氧化剂抗坏血酸的实验，证实了HS1酶促反应的特异性。结构域互换实验表明，HS1和HS2的差异区域1和2决定了酶活性差异。AlphaFold 3预测的HS1-FAD复合物结构分子对接分析发现，底物结合口袋中的多个亲水氨基酸残基（Y101、N250、N252、R257、N271和N353）通过亲水相互作用稳定底物，点突变实验证实这些残基（除N271外）对立体选择性羟基化至关重要。

蛋白互作研究表明，HlPT1L与HlPT2和HlMO18均存在相互作用，形成蛋白复合物，而HlPT2与HlCCL2/4和HlMO18仅存在弱相互作用。亚细胞定位证实HlMO18与HlPT1L在质体周围共定位，支持其在植物体内形成功能复合物的可能性。有趣的是，催化失活的HS1突变体在酵母系统中显著促进β-酸生成，提示PT-MO蛋白复合物可能通过代谢通道化调控中间产物流向。

该研究最终证实HlMO18-2（HS1）是啤酒花中长期寻找的(6S)-α-苦味酸合酶1（Hl(6S)-α-BAS1），解决了α-酸生物合成最后一步氧化反应的酶学机制问题。研究不仅深化了对啤酒花特殊代谢网络的理解，更为通过合成生物学策略构建高产(6S)-α-酸酵母工程菌株提供了关键靶点，对降低啤酒生产成本、提升风味品质具有重要应用价值。尽管酵母系统与天然啤酒花腺毛中(6S)/(6R)比例仍存在差异，提示可能存在其他增强立体选择性的辅助因子，但本研究为最终解析啤酒花腺毛高效代谢工厂的组装机制奠定了坚实基础。随着单细胞测序技术在植物特殊代谢研究中的广泛应用，未来有望在更高分辨率下揭示啤酒花盾状腺毛的细胞组成和途径分区，为构建类腺毛高效生产系统提供完整蓝图。