中性粒细胞与淋巴细胞比值（NLR）对鹦鹉热衣原体所致重症社区获得性肺炎的预测价值及临床特征分析

本综述系统回顾了鹦鹉热衣原体（Chlamydia psittaci）感染所致重症社区获得性肺炎（CAP）的临床特征及危险因素。研究通过mNGS（宏基因组下一代测序）技术确诊24例患者，发现重症组在白细胞（WBC）、中性粒细胞、NLR（中性粒细胞-淋巴细胞比值）、超敏C反应蛋白（hs-CRP）和降钙素原（PCT）水平显著升高，且真菌共感染率更高。多变量回归证实NLR是预测重症的独立风险因子（OR=1.103）。研究强调NLR可作为早期识别重症鹦鹉热肺炎的实用工具，为优化治疗策略提供依据。

　　

ABSTRACT

本研究旨在描述鹦鹉热肺炎的临床特征并识别与重症鹦鹉热肺炎相关的风险因素。我们回顾性收集了2022年1月至2024年6月经宏基因组下一代测序（mNGS）确诊的鹦鹉热肺炎患者数据，并分析了重症与非重症组之间的差异。共纳入24例患者（8例重症/16例非重症），重症鹦鹉热肺炎发生率为33.3%。重症组的白细胞（WBC）、中性粒细胞、中性粒细胞与淋巴细胞比值（NLR）、超敏C反应蛋白（hs-CRP）和降钙素原（PCT）水平以及mNGS检测真菌的阳性率显著高于非重症组。重症组的住院时间和奥马环素使用时间更长。受试者工作特征（ROC）曲线表明，NLR对重症病情的预测价值优于PCT和hs-CRP。鹦鹉热肺炎患者的重症发生率较高，NLR可能是一个有用的工具，可及时确定疾病严重程度并优化治疗方案以改善预后。

INTRODUCTION

鹦鹉热肺炎是由鹦鹉热衣原体（Chlamydia psittaci）引起的一种传染病，这种胞内细菌常感染鸟类和鸭子，随后传播给人类。鸟类中衣原体感染的流行率为19.5%，而鹦鹉热肺炎的感染率因气候、温度、职业、暴露和饮食习惯的不同而有很大差异。鹦鹉热衣原体是一种革兰氏阴性细菌，具有双相发育，包括网状体（RB）向原体（EB）的分化，其对人类的病理损伤主要由宿主对鹦鹉热衣原体的免疫反应决定。患者通过吸入污染的气溶胶感染鹦鹉热衣原体。病原体最初附着在呼吸道上皮细胞上，随后在单核吞噬细胞内建立细胞内生态位，并利用这一区室逃避宿主免疫防御和溶酶体降解。鹦鹉热在个体中的临床症状从无症状感染到严重肺炎甚至死亡不等，这是由于许多器官中广泛的上皮和巨噬细胞感染所致。症状的非特异性与流感、2019冠状病毒病（COVID-19）和其他呼吸道病原体重叠，导致鹦鹉热的临床误诊率高达50%–80%。

鹦鹉热的传统诊断方法，如鹦鹉热衣原体培养和聚合酶链反应（PCR），存在局限性。因此，一种高灵敏度、广谱的检测鹦鹉热衣原体核酸的方法，即宏基因组下一代测序（mNGS），在过去几十年中越来越多地应用于传染病的诊断。鹦鹉热衣原体的适用药物包括四环素类、大环内酯类和喹诺酮类。

近年来，许多研究关注不同国家和地区的鹦鹉热临床特征，但这些队列之间没有一致的结论。鸭子是鹦鹉热衣原体的天然宿主。据报道，南京人一年可消费1亿只鸭子，位居中国前列。因此，我们进行了一项回顾性研究，分析在南京医科大学第一附属医院经mNGS诊断的鹦鹉热临床特征，并比较重症鹦鹉热肺炎患者与非重症患者。本研究旨在调查鹦鹉热的临床特征和严重程度的危险因素。

MATERIALS AND METHODS

研究设计与参与者

在这项回顾性单中心研究中，所有入选患者均为2022年1月至2024年6月期间入住南京医科大学第一附属医院的鹦鹉热肺炎患者。由于本研究为回顾性，书面知情同意被豁免。研究遵循赫尔辛基宣言的指导原则进行。所有参与者均根据美国胸科学会（ATS）/美国感染病学会（IDSA）指南进行诊断和分组。

mNGS的工作流程（样本处理、DNA/RNA提取、DNA/RNA文库构建、测序和生物信息学分析）

mNGS按照先前描述的方法进行。简要来说，通过支气管镜（OLYMPUS）从患者肺部病变相应部位收集支气管肺泡灌洗液（BALF）样本（2–3 mL）。BALF样本立即离心，并进行珠击机械破碎（杭州矩阵生物科技有限公司）。使用NGSmaster自动核酸检测反应和构建系统从标本中提取基因组DNA和RNA。通过使用SuperScript双链cDNA合成试剂盒（11917020, Invitrogen）将RNA反转录为互补DNA（cDNA），然后进行核酸片段化、末端修复、末端腺苷化、接头连接和纯化，构建DNA和RNA病原体的混合测序文库。使用Qubit 3.0平台（Thermo Fisher Scientific, USA）和Agilent 2100 Bioanalyzer仪器（Agilent Technologies）评估文库的质量。文库测序在Illumina NextSeq 550上进行。

病原微生物基因数据的生物信息学分析在Gentellix软件上自动处理，生成检测报告，包括消除低质量或未检测到的序列、高覆盖率重复序列、剪接污染物和短读长序列。为了去除人类宿主序列，将测序数据与人类参考基因组（GRCh38.p13）进行比较。其余序列与NCBI GenBank和先前构建的参考数据库进行比对以识别病原体；识别出的读段及其相对丰度通过每千万读段数（RPTM）进行标准化以确定阳性结果。相对丰度是指每个样本中去除宿主序列后，某种微生物序列在五大微生物中的分布比例。mNGS阳性的标准如下：（i）每个标本的总测序数至少为2000万读段。（ii）对于常见物种，如病毒、细菌（不包括分枝杆菌）和寄生虫，这些识别出的微生物的覆盖率是其他微生物的十倍。（iii）由于生物量低和DNA提取困难，真菌（如曲霉和念珠菌）的覆盖率是其他真菌的五倍。

诊断和分组标准

鹦鹉热肺炎的纳入标准如下：（i）符合ATS/IDSA指南的社区获得性肺炎（CAP）诊断标准的患者。（ii）在支气管肺泡灌洗液（BALF）、痰液或血液的系列样本中通过mNGS检测到特定的鹦鹉热衣原体DNA片段。关于样本选择，支气管肺泡灌洗液（BALF）是主要的样本类型。然而，两名患者拒绝采集BALF，仅提供了血液样本。一名患者提供了BALF、血液和痰液标本，另一名患者提供了配对的BALF和血液样本。其余20名患者仅通过BALF进行诊断评估。排除数据不完整的患者。

重症肺炎的定义是基于ATS/IDSA CAP指南，患者满足一条主要标准或三条及以上次要标准。主要标准为（i）需要机械通气的呼吸衰竭和（ii）需要血管加压药的感染性休克。次要标准为（i）呼吸频率≥30次/分钟；（ii）PaO₂/FiO₂ ≤250 mmHg；（iii）多肺叶浸润；（iv）意识模糊/定向障碍；（v）血尿素氮水平≥7.14 mmol/L；（vi）白细胞计数≤4000细胞/μL；（vii）血小板计数≤100,000/μL；（viii）核心温度<36°C；（ix）收缩压<90 mmHg需要积极液体复苏。

数据收集

从电子病历中提取临床症状、动态变化、既往史、实验室检查、胸部计算机断层扫描（CT）和mNGS报告的数据。病原体的诊断由临床医生根据临床特征、实验室检查和影像学确定。此外，mNGS按照先前描述的方法进行。简而言之，收集包括支气管肺泡灌洗液（BALF）、痰液和血液在内的样本，提取核酸，构建脱氧核糖核酸（DNA）文库，进行测序并通过生物信息学方法进行分析。还收集了有关治疗、结果和相关随访影像学的额外信息。

统计分析

所有数据使用SPSS version 26.0软件和GraphPad Prism 8.0软件进行分析。对于呈正态分布的连续变量，数据以均值±标准差表示，两组间采用独立样本t检验。对于非正态分布的连续变量，数据以中位数（四分位距[IQR]）描述，并使用Mann-Whitney U检验进行分析。对于分类变量，数据以数字（百分比）表示，并通过Pearson χ2或Fisher精确检验进行分析。缺失值表现出与临床方案一致的非随机模式（例如，病情稳定的患者省略血气分析；非糖尿病患者省略HbA_1c检测）。因此，这些变量在单变量分析中保留，但在多变量回归中通过列表删除法排除。对于异常值（超过四分位数3×IQR或超出临床阈值），所有实例均由两名临床医生进行盲法验证。生物学上合理的异常值被保留并通过Huber回归进行分析以最小化杠杆影响。全面的稳健性分析证实了所有方法学结论的一致性。进行Pearson相关分析以评估中性粒细胞与淋巴细胞比值（NLR）、降钙素原（PCT）、C反应蛋白（hs-CRP）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）和病原体数量之间的相关性。鹦鹉热衣原体的读段和相对丰度呈非正态分布。临床结局（重症肺炎状态和出院后转至二级医院）被二分类。进行Spearman等级相关分析以分析鹦鹉热衣原体参数（读段、相对丰度）与炎症标志物（NLR、PCT和hs-CRP）或临床结局之间的关联，相关系数报告为Spearman's Rho (ρ)。使用受试者工作特征（ROC）曲线和曲线下面积（AUC）比较炎症标志物在预测鹦鹉热肺炎严重程度方面的价值。双尾P值<0.05被认为具有统计学显著性。

RESULTS

入选患者的一般特征

本研究最终共纳入24例患者，重症肺炎的发生率约为33.3%。入选患者的基本特征和临床症状列于表1。约一半患者主要在冬季感染（12例，50.0%），有鸭、鸽、鸡和鹦鹉接触史（45.80%）。重症组和非重症组在住院时间上观察到显著差异，而在年龄、季节、暴露和潜伏期方面无显著差异。

所有患者均有发热（体温范围38°C至41°C）。其他常见症状为咳嗽（79.20%）、呼吸困难（58.30%）、疲劳（60.90%）以及神经系统体征，包括头痛（50.00%）和意识障碍（24.20%）。然而，重症组和非重症组在临床症状方面无显著差异，包括呼吸系统相关症状（咳嗽为87.50% vs 75.00%；咳痰为50.00% vs 37.50%；呼吸困难为62.50% vs 56.30%）、神经系统症状（头痛为50.00% vs 50.00%；意识障碍为37.50% vs 25.00%）和消化系统症状（呕吐为50.00% vs 25.00%；腹泻为0.00% vs 12.50%）。

两组实验室检查结果的比较

入选患者的实验室检测结果详见表2。与非重症组相比，重症肺炎患者的白细胞（WBC）、中性粒细胞、NLR、hs-CRP和PCT水平较高（P < 0.05）。值得注意的是，如图1所示，重症组的血红蛋白（Hb）和PaO₂/FiO₂显著低于非重症组。在淋巴细胞、血小板、pH、D-二聚体、估算肾小球滤过率（eGFR）、纤维蛋白原（FIB）、ALT、AST、葡萄糖、游离三碘甲状腺原氨酸（FT₃）、游离甲状腺素（FT₄）和促甲状腺激素（TSH）水平方面未观察到显著差异。

影像学表现

所有受试者在入院期间均接受了CT扫描。两组的影像学特征列于表3。患者主要发展为大叶性肺炎。病变双侧10例（41.70%），单侧14例（58.30%），其中左肺9例，右肺5例。重症组和非重症组在病变分布上无显著差异。胸腔积液发生20例（83.30%），其中双侧积液14例（58.30%）。重症组和非重症组在胸腔积液方面无显著差异。

重症和非重症肺炎组的其他病原体共感染情况

使用mNGS共鉴定出24例鹦鹉热衣原体感染患者；读段和丰度差异很大。如表4所示，重症组通过mNGS检测到的平均病原体数量（4.38 ± 2.32）显著多于非重症组（1.94 ± 1.39）。在24例患者中，15例（62.50%）疑似与其他病原体共感染；然而，在共感染检出率或细菌和病毒的检出率方面无显著差异。值得注意的是，mNGS结果显示，重症组真菌检出率（50.00%）显著高于非重症组（6.30%）。重症组真菌共感染的发生主要与白色念珠菌（3/37.50%）、曲霉（3/37.50%）和耶氏肺孢子菌（1/12.50%）相关。mNGS检测中共感染微生物的比例如图2所示，这些患者的抗真菌治疗详情列于表5。

治疗与预后

在合并症方面，入选患者往往表现出一项或多项功能障碍。如表4所示，高纤维蛋白原血症、肝损伤和低白蛋白血症是所有患者中最常见的三种紊乱，均高于50.00%。在高血压、糖尿病、脑梗死、肾损伤、贫血、高纤维蛋白原血症和低白蛋白血症的发生率方面未观察到显著差异，而心功能不全在重症组中显著高于非重症组。

氧气和其他生命支持是维持全身的重要策略。约70.00%的患者接受了至少一种氧疗。在重症组中，87.50%接受了有创通气。在非重症组中，50.00%通过鼻导管吸氧。值得注意的是，两例重症病例通过静脉-静脉体外膜肺氧合（V-V ECMO）支持以维持其呼吸和循环平衡。

抗生素对于治疗鹦鹉热至关重要。抗生素使用的中位天数为24天，两组间具有可比性。超过一半的患者使用了米诺环素，一半的患者使用了奥马环素。约四分之一的患者使用了莫西沙星，五分之一的病例使用了阿奇霉素。两组间的给药频率具有可比性。然而，重症组奥马环素使用的平均天数（11天）显著长于非重症组（4天）。

在24例患者中，所有患者均恢复良好，仅五分之一的患者转至基层医院，其余患者带口服处方药或无任何药物出院。与非重症组（6.30%）相比，重症组转至基层医院的患者比例更高（50.00%）。

鹦鹉热衣原体所致重症肺炎的预测因素

为确定判断鹦鹉热患者状态的代表性标志物，进行了Pearson相关分析以评估常见实验室检查之间的关联。本研究中存在显著差异的常见炎症标志物包括WBC、中性粒细胞、NLR、hs-CRP和PCT（所有P < 0.05）。鉴于WBC和中性粒细胞与NLR密切相关，我们采用NLR来展示外周血的炎症状态。相关系数显示在图3中。相关分析显示，NLR与hs-CRP（r = 0.68, P < 0.05）、PCT（r = 0.60, P = 0.003）、ALT（r = 0.68, P < 0.05）和AST（r = 0.51, P = 0.011）呈正相关，而PCT与mNGS检测到的病原体数量（No.p）呈正相关（r = 0.63, P = 0.001），表明NLR和PCT可能是反映疾病状态的有价值标志物。此外，进行Spearman相关分析以探讨鹦鹉热衣原体测序指标（读段和相对丰度）与临床变量之间的关联。相关系数（ρ）展示在表6中。相关分析显示，鹦鹉热衣原体的读段和相对丰度均与NLR呈正相关（读段：ρ = 0.46, P = 0.032；相对丰度：ρ = 0.44, P = 0.040）。值得注意的是，相对丰度还与出院后转至二级医院的临床终点呈正相关（ρ = 0.45, P = 0.034）。

因此，我们采用ROC曲线来评估和比较不同炎症标志物对鹦鹉热衣原体感染患者严重程度的预测价值。如图4所示，NLR在预测重症肺炎方面表现出更好的效果，最大AUC（曲线下面积）为0.8125（P < 0.05）。PCT在预测疾病严重程度方面似乎优于hs-CRP，AUC分别为0.8083（P < 0.05）和0.7734（P < 0.05）。

考虑到NLR可能是ATS/IDSA CAP标准的一个混杂因素，应用逻辑回归模型来探索与重症组相关的独立因素。由于本研究的样本量相对有限，回归模型中涉及的变量应少于三个。通过Nagelkerke R2和Hosmer-Lemeshow检验（H-L检验）判断拟合优度。如表7总结，结果显示NLR是预测重症组的独立风险因素（OR = 1.103, 95% CI 1.001–1.216, P < 0.05）。

影像学随访

在随访方面，12例患者在出院后15–180天接受了CT扫描。大多数患者的原发病变几乎完全吸收，其余患者的原发病变和胸膜浸润也有一定程度吸收。然而，重症肺炎患者往往表现出残留的条索影和纤维化，无需额外治疗。治疗前后的一些代表性图片如图5所示。

DISCUSSION

本研究发现，鹦鹉热患者往往在秋冬季接触鹦鹉和鸭子后感染。此外，患者表现出一系列症状，包括发热、咳嗽、呕吐和意识改变。实验室检查显示，鹦鹉热影响炎症水平、造血系统、凝血系统、内分泌系统、肝功能和肾功能，并伴有多种病原体。影像学显示肺部各种病变和胸膜浸润。在治疗方面，四环素是常用策略，患者经过适当治疗后恢复良好。与非重症组相比，重症组鹦鹉热患者的住院时间更长；WBC、hs-CRP、PCT和NLR水平更高；真菌共感染比例更高；奥马环素处方时间更长。此外，NLR在预测疾病严重程度方面的价值优于CPR和PCT。

鹦鹉热是由鹦鹉热衣原体感染引起的一种重要的人畜共患病。由于是胞内细菌，通过传统方法（如分离培养）检测鹦鹉热衣原体可能困难且耗时。随着mNGS和tNGS的快速发展，鹦鹉热衣原体的检出率有所提高，美国、中国、德国等报道的病例越来越多。

本研究发现11例（45.8%）有明确的鸟类或家禽接触史，这与之前的研究一致。然而，我们研究中的一些结果与之前的研究不同。例如，本研究中接触野鸭的环境暴露患者占16.7%，重症患者占25.0%，而之前的研究通常将鸭和鸡合并为家禽，而不是单独列出鸭子。此外，本研究中接触鹦鹉的比例（16.7%）高于之前的研究（5.4%），暗示文化或地理因素可能影响鸟类或家禽的接触。与之前的研究相似，本研究发现从发病到诊断的中位时间约为10天，较长的持续时间可能解释为何患者无法回忆起明确的接触史。

由于与其他肺炎相似且症状非特异性，鹦鹉热在初期常被低估或误诊。据报道，鹦鹉热衣原体可侵袭广泛的上皮和单核巨噬细胞，引起一系列临床表现。与之前的研究一致，我们的研究揭示鹦鹉热的常见症状主要包括发热、咳嗽、疲劳、呼吸困难、头痛和呕吐，类似于涉及神经和消化系统的疾病。由于头痛、头晕或意识障碍，几名患者最初入住神经科并接受了腰椎穿刺。重症组和非重症组患者之间未观察到显著差异，暗示仅从临床症状区分重症组和非重症组的困难。

实验室检查显示，重症鹦鹉热患者的WBC、中性粒细胞、NLR、hs-CRP和PCT水平高于非重症组，而Hb和PaO₂/FiO₂降低。约92%的患者出现高纤维蛋白原血症，83%出现肝损伤，71%出现低白蛋白血症，这与之前的数据不同。肝酶如ALT和AST的水平在两组间无显著差异，但水平高于几项研究。值得注意的是，本研究中ALT水平约为110 U/L，与报道的46至63.5 U/L范围相比有近两倍的变化，揭示本研究中患者更易涉及肝损伤，临床实践中需要维持肝功能的保护策略。本研究中重症组的炎症标志物，如NLR、PCT和hs-CRP较高，表明存在多种病原体的混合或复杂感染。

来自不同样本的mNGS结果证实了混合感染假说。本研究中62.50%的患者存在混合感染，共感染主要与病毒相关，不同于中国的另一项研究，该研究报告的共感染率为41.30%。值得注意的是，mNGS检测到多种病原体并展示了所有病原体的读段，这需要医生根据其专业知识区分真正的病原体、机会性病原体、常驻菌群和污染菌群，并做出适当决策。重症组患者的共感染率为87.50%，主要病原体包括单纯疱疹病毒（HSV）、EB病毒（EBV）、肠道菌群和白色念珠菌，这与先前的研究部分一致。重症组和非重症组在共感染率方面无显著差异；然而，重症组真菌共感染的发生率高于非重症组，这可能导致更复杂的状况和不良结局。许多研究报告了重症组的不良结局如死亡，而本研究的所有参与者在住院期间均未死亡，这可能与本研究中鹦鹉热的多重治疗有关。

氧气支持在维持呼吸和循环系统方面起着重要作用。在本研究中，有创通气常用于重症组，而鼻导管常用于非重症组。呼吸支持的频率和方法因研究而异。在四项分别包含53例、39例、27例和20例重症鹦鹉热患者的研究中，有创通气的频率分别为39.6%、41.0%、44.4%和20.0%。本研究中