新型人羊膜上皮细胞系HAT的建立及其在高产量AAV载体生产中的应用突破

本刊推荐：为解决AAV载体生产产量不足的行业瓶颈，研究团队利用人羊膜上皮细胞（hAECs）开发了新型HAT细胞系。该细胞在无血清悬浮培养中展现出卓越的增殖能力和AAV生产能力，产生的AAV2/AAV8载体具有更高比例的全衣壳（20.6%/27.1% vs HEK293的6.0%/12.6%）和更低宿主细胞DNA残留。规模化生物反应器实验证实其良好扩增性，为基因治疗药物产业化提供了全新平台解决方案。

　　

在基因治疗领域迅猛发展的今天，腺相关病毒（AAV）载体因其非致病性、持久表达和组织靶向性等特点，已成为体内基因治疗的首选递送工具。随着全球范围内8款AAV基因疗法产品获得美国FDA和/或欧洲EMA批准，以及超过200项相关临床试验的开展，对高质量AAV载体的需求呈现爆发式增长。然而，当前主流的HEK293细胞生产系统面临产量瓶颈——病毒载体收获液滴度通常仅在1×10¹⁴-1×10¹⁵ vg/L之间，难以满足临床剂量需求。以杜氏肌营养不良症治疗药物Elevidys为例，单患者剂量高达2.1×10¹⁵ vg，这意味着一个200升生物反应器的产量仅能治疗约两名患者。这种产能困境直接导致基因治疗药物价格昂贵且可及性受限，成为制约领域发展的关键瓶颈。

为突破这一困境，日本千岁实验室公司与生物制品制造技术协会的研究团队另辟蹊径，将目光投向人类胎盘羊膜。人羊膜上皮细胞（hAECs）具有易获取、无伦理争议、低感染风险等优势，且原代细胞表现出多向分化潜能。研究团队通过将腺病毒5型E1基因（AdV5 E1）导入剖腹产获得的胎盘羊膜原代细胞，成功建立新型人羊膜上皮细胞系HAT（Human Amniotic epithelial cell line for gene and cell therapy）。经过悬浮培养适应和单细胞克隆筛选，最终获得的高产克隆HAT A2C1在无血清化学限定培养基中展现出卓越的增殖能力和AAV生产性能。

研究采用的主要技术方法包括：从健康产妇剖腹产捐赠的胎盘组织中分离原代hAECs；通过AdV5 E1基因转染实现细胞永生化；采用多步适应法将细胞从贴壁培养转化为悬浮培养；利用流式细胞分选仪进行单细胞克隆筛选；通过摇瓶和3升台式生物反应器进行规模化生产评估；采用液质联用（LC-FLR/MS）、质谱光度法、微滴式数字PCR（ddPCR）等多种先进分析技术对载体质量进行全面表征。

HAT A-2细胞的永生化特性

研究人员通过RT-qPCR检测发现，原始hAECs中人类端粒酶逆转录酶（hTERT）转录本低于检测限，而HAT A-2细胞中hTERT转录水平显著升高（p<0.005）。端粒酶重复扩增协议（TRAP）实验显示HAT A-2细胞存在6bp递增的端粒酶特异性梯带，且活性呈细胞数量依赖性，证实细胞已获得永生化特征。

HAT A-2细胞的鉴定与表征

短串联重复（STR）分析显示HAT A-2细胞与亲本hAECs具有相同的遗传谱系，且不同于任何已知细胞系。细胞表现出典型的上皮样铺路石形态，99.9%细胞表达上皮细胞标志物pan-cytokeratin。AdV5 E1蛋白（E1A、E1B 19K、E1B 55K）持续表达，水平与HEK293细胞相当。荧光原位杂交（FISH）分析发现所有检测细胞（n=10）均存在1号染色体三体性，以及1号和5号染色体之间的易位[t(1;5)]，转基因E1插入于1号和5号染色体的易位位点。

悬浮适应与单细胞克隆

HAT A-2细胞成功适应无血清悬浮培养，在HE400AZ培养基中达到14.1×10⁶ cells/mL的高细胞密度。从900多个单细胞克隆中筛选出的领先克隆HAT A2C1表现出增强的增殖能力，AAV2产量比亲本HAT A-2悬浮细胞提高约2.3倍。该克隆在5种测试血清型中均产生较高滴度（3.5×10¹³至2.1×10¹⁴ vg/L），与HEK293F衍生的VPCs 2.0细胞系表现相当。

HAT A2C1生产的AAV2载体特性

基因组包装分析显示，从5'ITR到ZsGreen1基因再到3'ITR的区域包装效率一致。质谱光度法分析显示空衣壳和满衣壳明显分离，HAT A2C1生产的AAV2载体满衣壳比例（20.6%）显著高于VPCs 2.0细胞（6.0%）。基因组与衣壳比率分析进一步证实了这一结果（21.7% vs 12.3%）。残留宿主细胞DNA（hcDNA）水平显著降低（6.3 vs 22.9 ng/10¹³ vg）。病毒衣壳蛋白（VP）比率分析显示VP1+VP2:VP3比率接近理想的1:5（1:5.5 vs 1:4.4）。

体外感染性分析

亲和纯化的AAV2-ZsGreen1载体在HEK293细胞中表现出有效的转导能力。在等效载体输入下，HAT A2C1生产的AAV载体产生的ZsGreen1阳性细胞数量显著高于VPCs 2.0细胞。经阴离子交换（AEX）色谱富满满衣壳颗粒后，两种载体制备物均表现出增强的转导效力，在MOI为5×10³ vg/cell时达到约70%的ZsGreen1阳性细胞，HAT A2C1生产的载体仍显示出更高的转导效率趋势。

规模化生物反应器生产

在3升一次性轨道摇动生物反应器中，HAT A2C1细胞表现出稳健的生长特性，整个生产过程中保持高活力。AAV8滴度在生产期间稳步增加，48小时转染后产量（1.8×10¹⁴ vg/L）已超过摇瓶规模72小时的产量（1.4×10¹⁴ vg/L）。质量属性分析表明，载体基因组谱和衣壳蛋白组成在两种生产规模间相当，生物反应器生产的载体显示出更高的满衣壳比例趋势。与VPCs 2.0细胞相比，HAT A2C1生产的AAV8载体满衣壳比例更高（27.1% vs 12.6%），残留hcDNA水平更低（2.4 vs 9.5 ng/10¹³ vg）。

研究结论表明，HAT细胞系成功解决了AAV载体生产中的关键瓶颈问题。其卓越的增殖能力（可达13.1×10⁶ cells/mL）和高转染效率（86.4%）为大规模生产奠定了基础。更重要的是，HAT细胞生产的AAV载体不仅产量高，而且质量显著提升——满衣壳比例提高3-4倍，残留宿主DNA降低3-4倍，这直接减轻了下游纯化工艺的负担并提高了最终产品的安全性。

值得注意的是，HAT细胞在不同血清型AAV生产中都表现出良好性能，特别是AAV5产量可达2.7×10¹⁴ vg/L。生物反应器规模实验证实了该细胞系的良好扩增性，产品质量在不同规模间保持一致性，这对于工业化应用至关重要。

第三方安全性评估按照ICH Q5A指南进行，包括无菌检测、外源因子检测、逆转录酶定量分析和支原体检测，所有指标均符合标准，STR分析与亲本HAT A-2贴壁细胞一致，确保了细胞系的安全性和遗传一致性。

该研究的创新性在于首次将人胎盘羊膜来源的永生化细胞应用于病毒载体生产，为基因治疗提供了全新的宿主细胞平台。与传统的HEK293细胞相比，HAT细胞不仅提供了产量和质量优势，还具有原材料易获取、无伦理争议、低感染风险等独特优势。研究人员指出，当前使用的培养基和转染试剂都是为HEK293系统设计的，尚未针对HAT A2C1细胞进行优化，这表明该平台还有进一步的改进空间。

这项研究为基因治疗产业提供了新的解决方案，有望显著降低AAV载体制造成本，提高治疗可及性。随着工艺的进一步优化和扩大生产，HAT细胞平台有望成为基因治疗药物生产的新标准，推动更多基因疗法惠及患者。