aggR序列变异检测对肠集聚性大肠杆菌精准分子诊断的重要性及三重PCR新策略的开发与验证

本综述系统分析了肠集聚性大肠杆菌（EAEC）分子诊断中aggR基因的序列变异问题，开发了可同时检测aggR、aatA和afpR的三重PCR方法，有效区分典型（tEAEC）与非典型（aEAEC）菌株，为EAEC的快速、精准诊断提供了重要技术支撑。

　　

ABSTRACT

肠集聚性大肠杆菌（Enteroaggregative Escherichia coli, EAEC）是腹泻的主要致病菌之一，其定义为在HEp-2细胞中观察到集聚性黏附（aggregative adherence, AA）模式。由于EAEC存在遗传异质性，其分子诊断仍面临挑战。不同研究曾报道使用针对aggR和aatA的引物进行EAEC鉴定。近年来，afpR被提议作为某些EAEC菌株的分子标记，表明该致病型中存在两个亚群：典型EAEC（tEAEC）和非典型EAEC（aEAEC），分别包含aatA⁺/aggR⁺和aatA⁺/afpR⁺菌株。然而，本研究团队在使用不同aggR引物对时得到了不一致的结果，强烈提示aggR序列存在变异。因此，本研究主要目的是分析aggR序列的变异及其对EAEC表征的影响，并确定通用引物。最终，我们提出了一个以aggR、aatA和afpR为靶标的三重PCR（triplex-PCR）方法，可一步实现对典型和非典型EAEC的分子诊断。

IMPORTANCE

EAEC的表型和基因型鉴定既耗时又存在灵敏度变异的问题。因此，开发针对该大肠杆菌致病型的准确分子诊断方法对公共卫生具有重要意义。本研究分析了当前用于检测典型EAEC相关基因（aatA和aggR）以及作为非典型EAEC标记afpR的引物。经过广泛的文献回顾，发现aatA引物适合其广泛检测，而目前已报道的aggR引物对均无法检测到该基因的所有变异体。为解决此问题，我们提出了aggR的通用引物以改进对所有aggR变异体的检测。考虑到对快速准确EAEC诊断方法的需求，我们开发、验证并优化了一个三重PCR检测方法，该法结合了通用aggR引物以及aatA和afpR引物，可同时检测典型和非典型EAEC。

INTRODUCTION

EAEC是全球范围内儿童和成人腹泻的最普遍病原体之一，亦与旅行者腹泻及众多腹泻暴发相关。在低收入国家，无症状携带EAEC的儿童更可能出现疫苗反应减弱、生长发育迟缓和认知障碍。近年来，EAEC也从血流感染和尿路感染病例中被分离出来。

该致泻性大肠杆菌致病型由Nataro等人首次描述，其最初特征是在HEp-2细胞试验中观察到的AA模式，细菌以堆砌砖块样模式黏附于细胞和盖玻片。尽管耗时且需要专业的实验室结构和训练有素的人员，此特征一直被认为是EAEC鉴定的金标准。在此背景下，分子方法成为重要的诊断工具。不同的EAEC遗传标记已被用于流行病学研究。CVD432探针是第一个被描述并用于EAEC鉴定的分子工具。随着时间的推移，其他基因通过PCR被用于广泛检测EAEC，包括染色体编码基因（aaiC或aaiG）和/或质粒携带基因（aggR、aatA或aap）。除作为VI型分泌系统（T6SS）组成部分的aaiC和aaiG外，aggR、aatA和aap位于一个名为pAA的毒力质粒上，该质粒也携带负责EAEC特殊结构——集聚性黏附菌毛（AAF）生物合成的基因。目前已知，aatA（先前称为CVD432探针）是一个编码I型分泌系统（T1SS）的操作子的一部分；aggR编码EAEC毒力基因的转录调节因子；aap编码抗聚集蛋白分散素（dispersin）。术语非典型EAEC（aEAEC）被提出用以包括那些呈现AA模式但缺乏aggR序列、提示缺少pAA质粒的EAEC菌株，而典型EAEC（tEAEC）则包括那些携带aggR的EAEC。

最近，在携带aap和aatA但缺乏aggR的产志贺毒素EAEC菌株中鉴定出了AA相关质粒（pAFP）。这些菌株携带afpR，它是集聚形成菌毛（AFP）操作子的AraC型调节因子。在最初关于杂交菌株中AFP的报道之后，进一步的基因组分析揭示了从粪便样本中分离的EAEC菌株中存在AFP操作子。

我们研究团队早期的流行病学研究使用CVD432探针鉴定EAEC菌株。在近期的研究中，EAEC菌株通过检测aatA和aggR遗传标记的PCR进行鉴定。在我们的常规工作中，一些最初使用CVD432鉴定为EAEC的菌株，在采用文献中描述的不同引物对进行aggR检测时，得到了令人困惑的不同结果，这强烈提示aggR存在序列变异。

为澄清此现象，本研究进行了广泛的基于文献的检索，靶向已发表的用于EAEC分子检测的引物。确定了aggR的广谱引物，并将其与aatA和afpR引物相结合，开发了一个用于检测典型和非典型EAEC的三重PCR方法。

MATERIALS AND METHODS

引物选择与数据库构建

于2022年11月进行了基于文献的检索，靶向已发表的用于aggR、aatA和afpR分子检测的引物。在PubMed数据库中检索了相关术语，共审查了1578项研究，以寻找所使用的寡核苷酸描述。从中识别出9对重复出现的引物对，并选择其原始文章作为后续分析的基础。

同时，分析了NCBI数据库中FASTA格式的可用大肠杆菌基因组，重点识别aggR、aatA和afpR基因。共选择了257个包含这些EAEC标记之一的基因组序列用于构建数据库。最终，筛选出508条完整的核苷酸序列（224条aggR、251条aatA和33条afpR）。使用Sublime Text 4软件构建了三个独立的数据库（每个靶基因一个）。这些数据库可在Butantan研究所知识库公开获取。

多序列比对、引物分析与选择

使用Geneious Prime 2023.2软件和MUSCLE算法进行了多序列比对，以识别每个数据库序列中的保守和可变区域。生成的比对结果用于确定设计用于检测aggR、aatA和afpR的正向和反向引物在保守区内的退火位点。使用在线工具（Sequence Manipulation Suite, version 2）中的PCR Products工具，在aggR数据库中评估了所有先前发表引物与相应候选引物在aggR检测率上的差异。基于其相应数据库的多序列比对，使用Geneious Prime 2023.2软件设计了用于afpR检测的替代引物。

aggR、aatA和afpR候选引物的选择

用于检测aggR、aatA和afpR的候选引物见表1。通过计算机模拟（in silico）计算了扩增子大小，考虑了所选引物对在NCBI数据库参考基因组中的退火位点：EAEC原型菌株042（从粪便中分离）的aggR和aatA序列（登录号NC_017627.1）；以及UPEC-46（一种从尿路感染中分离的EAEC/UPEC杂交菌株）的afpR序列（登录号NZ_JAHBCK010000003.1）。模板DNA通过将LB琼脂上的菌落在200 μL水中煮沸10分钟制备。

按表1所述进行单重PCR反应，并通过1%琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。使用的对照菌株见表S1。同时使用无DNA反应作为阴性对照。使用Monarch PCR & DNA Cleanup Kit纯化aggR和afpR扩增子，并送至圣保罗大学人类基因组和干细胞研究中心进行Sanger测序。将获得的序列与上述aggR和afpR参考序列进行BLAST比对分析。

用于EAEC检测的三重PCR

在用对照菌株单独验证了所选用于aggR、aatA和afpR的引物后，标准化了一个靶向这三个基因的三重PCR。按上述方法获取DNA，并使用包含EAEC 042和UPEC-46 DNA的混合池作为阳性对照。表1提供了为三重PCR方案定义的条件。

用于EAEC检测的三重PCR的验证

首先通过测试五种致病性大肠杆菌原型菌株和大肠杆菌DH5α来评估三重PCR的特异性（表S1）。同时，还测试了24株在HEp-2细胞上呈现AA模式但经分子鉴定为典型肠致病性大肠杆菌（tEPEC）、非典型EPEC（aEPEC）或产志贺毒素大肠杆菌（STEC）的大肠杆菌菌株（表S2）。通过测试163株来自儿童急性腹泻病因流行病学研究的aatA阳性EAEC分离株（表S2）来验证三重PCR的特异性。

三重PCR的结果通过进一步检测53株aatA阳性EAEC菌株（表S2）中aggA、aafA、agg3A、agg4A、agg5A（五种AAF变异体的菌毛蛋白编码基因）、afpA1（AFP的菌毛蛋白编码基因）以及cseA（CS22的菌毛蛋白编码基因）的存在情况（表S3）进行了补充。其余110株菌株已在先前的研究中评估了这些基因。

RESULTS

用于aggR、aatA和afpR检测的引物的选择与分析

基于文献的检索为每个靶基因提供了不同数量的引物（图1至图3）。对aggR引物的检索得到了9对原始引物对。对224条aggR序列的多序列比对显示，序列变异贯穿整个基因序列，并且大多数分析的引物序列退火到这些区域（图1）。只有一对分别由Czeczulin等人和Trung等人提出的正向和反向序列退火到保守位点，因此被选作aggR检测的通用引物对。

这种具有可变退火区的aggR引物的多样性表明，一些EAEC菌株在aggR检测上可能呈现不同的结果。为此，我们比较了先前发表引物与通用引物在aggR检测阳性率上的差异（图1）。对文献中描述的引物进行的计算机模拟分析显示，在分析的224株菌株中，aggR检测率为58%–92.9%，而本研究中使用的通用引物检测率达到100%，展示了优异的诊断性能。

发现了两个用于aatA检测的原始引物对（图2）。图2显示了使用通过251条序列数据库获得的多序列比对得出的aatA引物退火位点。两套引物的正向和反向序列在aatA的重叠区域退火，分析的序列之间存在少量核苷酸变异，表明两对引物都适合aatA的广泛检测（图S1）。选择由Schmidt等人首次描述的引物对纳入三重PCR。

关于afpR，Lang等人提出的引物是文献中唯一描述的（图3）。尽管反向序列退火到一个完全保守的位点，但对应于正向序列3'末端的单个核苷酸退火到一个变异点。最初，通过排除这个3'末端核苷酸对正向引物进行了调整。然而，使用调整后序列标准化三重PCR方案的尝试失败了，为此设计了一对新的afpR检测引物对（图3）。

在单重PCR后，对得到的aggR和afpR扩增子进行了纯化和测序。扩增子与相应aggR（EAEC 042）和afpR（UPEC-46）序列的正确比对（图S2和S3）使得提出一个用于广泛EAEC检测的三重PCR成为可能（表1）。

用于EAEC检测的三重PCR的标准化

在用各自对照菌株单独验证了所选引物后，通过评估不同大肠杆菌菌株，标准化了一个靶向aggR、aatA和afpR的三重PCR方案。测试了EAEC、EPEC和尿路致病性大肠杆菌（UPEC）原型菌株以及大肠杆菌DH5α。图4A显示只有EAEC（042和17-2）和杂交EAEC/UPEC（UPEC-46）呈现出对应于靶基因的扩增子。同时，还测试了24株遗传学上未分类为EAEC但呈现AA模式的大肠杆菌菌株（图4B）。正如预期，它们全部对aatA、aggR和afpR的存在呈阴性，支持了该方案的特异性。

最后，使用三重PCR测试了163株临床EAEC菌株（图4C和表2）。使用通用引物在9株先前被认为是aggR阴性的aatA阳性菌株中检测到aggR（表2），显示了我们分子方法在检测EAEC菌株方面的有效性和特异性的提高。关于aatA的检测，结果成功复制了先前的数据，因为这些菌株中93.7%呈阳性。虽然10株aatA阳性菌株在我们的三重PCR中呈现不确定结果，但使用相同引物在单重反应中测试时，清楚地检测到了aatA扩增（图S4）。所有23株先前检测为aatA⁺/afpR⁺的菌株用新方案得到了一致的结果（表2），证实了新afpR引物的效力。

三重PCR结果证明了基于aggR存在与否的两个不同EAEC种群的存在

还评估了163株EAEC菌株中不同EAEC相关遗传标记的频率。我们的收集品中清楚地定义了两个主要亚组（表3）：一个亚组由140株tEAEC（aatA⁺/aggR⁺/afpR^-）组成，它们可能携带或不携带一种AAF菌毛；另一个包括23株aEAEC（aatA⁺/aggR^-/afpR⁺），携带AFP操作子。

DISCUSSION

本研究分析了当前用于检测典型EAEC相关基因（aggR和aatA）以及作为非典型EAEC标记afpR的引物。EAEC的表型和基因型鉴定既耗时又存在灵敏度变异的问题。因此，开发针对该大肠杆菌致病型的准确分子诊断方法对公共卫生具有重要意义。

文献中报道了九种不同的用于aggR检测的引物（图1），但从未提供过对其退火位点的详细分析。事实上，我们的研究首次证明了aggR序列变异的存在，表明多年来，许多大肠杆菌菌株可能在使用这些引物基于aggR检测的 assays（包括内部或商业分子试剂盒）中未被鉴定为EAEC。使用每对研究的引物对进行aggR检测的计算机模拟比较分析支持了这一假设，因为在我们数据库中aggR检测的频率在58%至92.9%之间。尽管解决了这些差异，我们的分析最终提出了一对aggR检测的通用引物，该引物完全退火到保守的aggR区域，允许基于截至2022年11月公共数据库中所有可用完整基因序列检测所有aggR变异体（图1）。

来自近期广泛遗传筛选和系统发育分析的数据强调了关于EAEC致病型的两个重要事实。首先，证据表明aatA是整个EAEC群的一个特异性遗传标记，因为没有报道称aatA存在于其他致泻性大肠杆菌致病型中。我们对24株在黏附试验中呈现AA模式（先前分类为EPEC或STEC）的致病性大肠杆菌菌株的分析未发现任何aatA阳性菌株。该基因存在于pAA和pAFP质粒中，这两个质粒已知携带AA相关遗传标记，例如AAF和AFP编码操作子。总之，这些证据支持aatA作为EAEC分子标记的特异性。其次，提示在EAEC致病型中存在两个主要群体：tEAEC（aatA⁺/aggR⁺/afpR^-）和aEAEC（aatA⁺/aggR^-/afpR⁺）菌株。因此，afpR很可能是aEAEC的特异性遗传标记。

由于这些菌株的基因型多样性，EAEC诊断目前对临床微生物学家来说是一个重大挑战。同样，一些最初定义EAEC的表型特征，如AA模式，也在其他大肠杆菌致病型甚至其他肠杆菌目（如奇异变形杆菌、肺炎克雷伯菌和弗氏柠檬酸杆菌）中观察到。因此，需要一种快速有效的分子方法来诊断这种相关的腹泻病原体。

各种分子靶点已被用于流行病学研究中的EAEC检测，最近的一项提议建议将EAEC定义为存在aggR以及一个完整的AAF操作子或CS22操作子。检测包含五个AAF编码操作子和CS22操作子的所有基因对分子诊断来说是一个重大挑战。而且，AAF编码基因的频率在不同的EAEC收集中有所不同，并且cseA作为EAEC检测标记的特异性是不确定的，因为它编码纤维黏附素CS22的结构亚基，该亚基最初被鉴定为肠产毒性大肠杆菌的定植因子。此外，该提议未能包括aEAEC检测，因为该群体特征性地缺乏aggR。检测非典型EAEC（aEAEC）具有重要意义，考虑到它从散发性急性腹泻病例中的分离、其在儿童和新生儿重大腹泻暴发中的参与、以及其在Galleria mellonella感染模型中证明的毒力。

最近，AFP操作子被鉴定出来，并与EAEC杂交菌株中的AA表型相关联，但其在不同EAEC菌株中的频率至今探索甚少。因此，在临床上区分典型和非典型EAEC菌株对于有效的流行病学监测和检测杂交菌株尤为重要，这些杂交菌株可能携带额外的毒力因子并带来诊断和治疗挑战。

第一个用于EAEC检测的遗传工具是Baudry等人开发的CVD432探针，后来被鉴定为对应于aatA并使用特异性引物进行检测。我们的包含这些aatA引物的三重PCR方案未能扩增出先前基于该基因检测选择的临床EAEC菌株中6.3%的该靶标。在三重反应中缺乏扩增可能是由于多种引物浓度的原因，但aatA的假阴性结果不会影响诊断结果。一株菌株如果aatA结果阴性但扩增出aggR（aatA^-/aggR⁺/afpR^-）或afpR（aatA^-/aggR^-/afpR⁺），仍可被鉴定为EAEC。另一种考虑aatA假阴性（aatA^-/aggR^-/afpR^-）的情况代表了一种在本研究分析的任何基因组中均未发现的EAEC遗传谱型。

除了检测数据库中100%的aggR序列外，所提出的通用引物提高了我们收集中9株先前aggR检测为阴性的aatA阳性菌株的检测率（表2）。关于afpR检测，设计了更特异的引物并进行了验证，使得在所有23株先前已知的aatA⁺/afpR⁺菌株中都能成功扩增。

最后，对我们大量EAEC收集品的广泛遗传表征清楚地指出了两个不同的EAEC群体，其他人也观察到了这一点：tEAEC（aatA⁺/aggR⁺/AAF⁺ 或 aatA⁺/aggR⁺/cseA⁺）和aEAEC（aatA⁺/afpR⁺/afpA1⁺）群体。有趣的是，在140株tEAEC中的5株和23株aEAEC中的1株中缺乏菌毛蛋白相关基因，尽管存在各自的调节因子aggR和afpR，这提示在我们的收集中存在不完全的操作子、菌毛蛋白编码基因变异、甚至未表征的黏附素。

总之，本研究结合使用通用aggR引物与靶向aatA和afpR的引物，开发了一个三重PCR检测方法，该方法可检测典型和非典型EAEC，并改善了临床实验室常规中的EAEC诊断。

ACKNOWLEDGMENTS

本研究得到了圣保罗研究基金会（FAPESP）的资助（Grant #2018/04144-0）。C.A.F.得到了FAPESP的奖学金支持（#2022/02861-2），A.M.G.D.C.得到了巴西联邦研究生教育支持与评估机构（CAPES）的奖学金支持（#88887.753154/2022-00）。