血液转录组解析发热伴血小板减少综合征相关脑炎的免疫基因表达谱与机制研究

本刊推荐：本研究通过转录组测序分析SFTS（Severe fever with thrombocytopenia syndrome）伴脑炎患者外周血单核细胞（PBMCs），首次揭示中枢神经系统症状与免疫相关基因表达改变密切相关。研究发现MET、KIT、IL1R2、MAFF、CD69和CEBPD等6个关键差异表达基因，为理解SFTSV（SFTS virus）神经侵袭机制提供了新视角，对开发早期诊断标志物和靶向治疗策略具有重要意义。

　　

ABSTRACT

严重发热伴血小板减少综合征（SFTS）是一种由SFTS病毒（SFTSV）引起的危及生命的蜱传人畜共患病，常导致以意识障碍和癫痫为特征的致命性脑炎。SFTSV神经侵袭和宿主驱动神经损伤的分子机制尚不清楚。为探究SFTS诱导脑损伤的机制，研究团队分析了南京鼓楼医院同期收治的5例SFTS伴脑炎患者和5例非脑炎患者的临床实验室参数及外周血单核细胞（PBMCs）转录组。研究结果表明，SFTSV感染的中枢神经系统表现与免疫相关基因表达改变相关。具体而言，研究团队在脑炎组和非脑炎组之间鉴定出6个差异表达的免疫基因——MET、KIT、IL1R2、MAFF、CD69和CEBPD。该研究为SFTS相关脑炎的发病机制提供了新见解，进一步研究SFTSV感染后的宿主免疫反应可能有助于减缓疾病进展和改善临床结局。

研究重要性在于：SFTS是一种可导致脑炎的高死亡率疾病，但其脑损伤机制未知。本研究采用先进基因测序技术分析伴/不伴脑炎的SFTS患者血液样本，揭示免疫相关基因的关键变化，阐明了病毒引起脑损伤的潜在生物学通路。这些发现为免疫系统如何导致SFTS神经系统并发症提供新解释，并指出可作为未来诊断或治疗靶点的特定基因。

INTRODUCTION

SFTS是一种新发传染病，由新型布尼亚病毒（SFTSV）引起，2009年首次在中国发现，后在多个东南亚国家报道。该病主要通过蜱虫叮咬传播，农村地区温暖季节发病率最高。临床表现为突发发热、血小板减少、白细胞减少和胃肠道症状，重症可进展为多器官功能障碍甚至死亡，死亡率达5%-30%。除全身症状外，SFTS还可累及中枢神经系统（CNS），相当比例患者出现脑炎或脑病，其中SFTS相关脑炎（SAE）死亡率高达44.7%。

尽管SFTS研究日益增多，但针对SAE的研究仍有限。既往研究主要关注临床特征和流行病学，对CNS受累机制关注较少。SAE诊断面临挑战，因缺乏明确临床标志物且脑脊液（CSF）样本采集不频繁。SFTSV在CNS的发病机制尚不明确，可能涉及直接病毒侵袭和免疫介导机制。尽管一些研究观察到SAE患者CSF中细胞因子水平升高，但对宿主免疫反应的全面理解仍欠缺。

病毒感染常引起宿主细胞转录组广泛改变，导致代谢失调和免疫功能障碍，最终形成有利于病毒复制的微环境。理解SFTSV发病机制（尤其对CNS影响）对制定有效治疗策略和预后生物标志物至关重要。PBMCs是易获取的免疫细胞来源，可反映宿主对病毒感染的免疫反应。PBMCs转录组分析为SFTSV感染期间发生的分子改变及SAE相关发病机制提供宝贵见解，目前缺乏针对SAE的转录组研究。

本研究采用高通量测序表征SAE和非脑炎患者PBMCs转录组谱，以识别疾病进展期间发生的改变，探索这些改变与SFTS的CNS表现之间的关联。研究鉴定出几个特征性免疫生物标志物，可能改善SFTS（尤其伴神经系统并发症患者）的管理。

MATERIALS AND METHODS

本研究回顾性纳入5例SAE患者和5例无神经系统并发症的SFTS患者作为对照。所有患者2021年5月至8月期间就诊于南京鼓楼医院，根据临床表现、流行病学史和实验室确认诊断。SAE纳入标准基于精神状态改变（如头痛、烦躁、嗜睡、意识模糊）持续至少24小时，且排除其他潜在病因。

多器官功能障碍综合征（MODS）阶段采集外周血样本，使用淋巴细胞分离液和磷酸盐缓冲盐水通过稀释、分层和离心分离单核细胞。提取总RNA，使用Agilent 2100 Bioanalyzer系统评估完整性和数量，RNA完整性数大于7.5的样本保留。按Illumina建库协议，使用Oligo（dT）磁珠富集mRNA，片段化后合成cDNA第一链和第二链。合格文库在Illumina NovaSeq 6000平台测序，产生150 bp双端读长。

使用FASTQ软件进行质量控制和平接头修剪，使用HISAT2比对器将双端清洁读段与参考基因组比对。使用FeatureCounts工具进行基因表达量化，使用DESeq2 R包进行差异基因表达分析，显著差异表达基因标准为|log₂Fold Change| > 1且P值 < 0.05。使用R语言EnhancedVolcano和heatmap包生成火山图和热图。使用DAVID在线工具进行基因本体（GO）富集分析和Reactome通路富集分析。使用fgsea R包进行基因集富集分析（GSEA）。使用CIBERSORT工具基于反卷积算法估计混合细胞群体中免疫细胞的组成和丰度。使用ImmPortDB数据库免疫基因列表分析比较组间免疫基因表达。基于Schoggins等发表的干扰素反应研究，通过转录组测序数据评估两组干扰素诱导基因表达。

使用R 4.1.0和SPSS 22.0进行统计分析，GraphPad Prism 9.0生成小提琴图。正态分布连续数据采用两样本t检验，分类数据采用Pearson χ²检验或Fisher精确检验，非参数中位数比较采用双尾Mann-Whitney U检验，P值 < 0.05认为有统计学意义。

RESULTS

患者 demographic 和临床特征显示：两组性别分布无显著差异，非脑炎组年龄大于脑炎组但无统计学意义。高血压和糖尿病是最常见基础疾病，两组无显著差异。所有患者均表现高热和乏力，最高体温无显著差异。其他常见症状（头晕、头痛、呕吐/腹泻、肌痛）无统计学意义，可能因测序组样本量小。标本采集时实验室检查显示：两组白细胞计数均减少但无显著差异；SAE患者中性粒细胞百分比正常，非SAE患者显著升高（P = 0.008）；两组血小板计数均下降，脑炎组中位数35 × 10⁹/L，非脑炎组50 × 10⁹/L，但差异无统计学意义。

动态实验室检查显示：SFTS自然病程分三个阶段：发热期（0–6天）、MODS期（7–13天）和恢复期。发热期脑炎组血清病毒载量、丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）水平较高，ALT和AST显著超出正常范围。疾病进展至第二期，非脑炎患者病毒载量显著降低，脑炎患者仍保持较高病毒拷贝数。与非脑炎患者相比，SAE患者乳酸脱氢酶（LDH）水平显著更高（P < 0.01），凝血酶时间（TT）延长（P < 0.01），表明疾病严重程度更高。

转录组分析显示：SAE患者与非SAE患者比较共鉴定出244个差异表达基因（DEGs），其中96个上调、148个下调。脑炎组钾离子通道相关基因KCNN3、细胞发育相关基因EMC8、DANCR和ASPN以及转录因子ZNF296显著上调；代谢相关基因MGAM、免疫相关基因LCN2和IL1R2、蛋白酶抑制剂PZP和细胞骨架蛋白MYO7A显著下调。GO富集分析显示：在生物过程（BP）类别，DEGs主要与细胞外基质组织、钾离子跨膜转运、炎症反应、生物胺代谢过程和先天免疫反应相关；在细胞组分（CC）类别，这些基因主要定位于突触前膜、细胞颗粒和外泌体；最富集的分子功能（MF）术语包括L-氨基酸跨膜转运蛋白活性、蛋白酪氨酸激酶活性和钙离子结合。Reactome通路分析显示这些基因显著参与中性粒细胞脱颗粒、细胞外基质降解、胶原降解、生物氧化过程和基质金属蛋白酶激活。这些DEGs在炎症反应、组织损伤、细胞代谢和免疫功能中起重要作用。

GSEA分析显示：非脑炎组特异性颗粒、分泌颗粒膜和三级颗粒的基因集下调，与GO的CC结果一致。脑炎组E2F靶点、未折叠蛋白反应和Myc靶点的基因显著上调，表明其在细胞增殖和应激反应中的作用。免疫特征基因集分析显示脑炎和非脑炎组之间免疫细胞状态和扰动存在显著差异，提示宿主免疫反应改变可能在SAE进展中起关键作用。

免疫失调分析显示：两组中最普遍的免疫细胞类型是单核细胞、静息自然杀伤（NK）细胞和CD4⁺ T记忆细胞，而功能性CD4⁺ T细胞、CD8⁺ T细胞和NK细胞显著减少。两组在先天和适应性免疫反应模式的免疫细胞组成相似，但各种免疫细胞类型的相对比例无显著差异。

免疫基因和干扰素刺激基因（ISGs）分析显示：脑炎组免疫相关基因MET和KIT上调，IL1R2下调；干扰素诱导基因MAFF和CD69相对上调，CEBPD下调。这些基因可能为SAE的潜在机制提供有价值见解。

DISCUSSION

脑炎发生显著导致SFTS不良预后和死亡率。多项研究证实SAE患者脑脊液中存在SFTSV，表明病毒可侵入CNS引起颅内感染和神经系统症状。目前SAE主要归因于直接病毒侵袭和细胞因子诱导的免疫病理损伤，但确切机制和宿主反应尚不清楚。本研究动态实验室检查发现SAE患者多个异常临床实验室参数，尤其LDH水平升高和TT延长，与既往研究一致。因样本量小，非显著发现需谨慎解读，需更大队列进一步研究。

PBMCs（主要由淋巴细胞和单核细胞组成）是临床诊断转录组生物标志物的宝贵来源，可反映对外部刺激的全局免疫反应。本研究对MODS期患者PBMCs进行全基因组RNA测序，分析SAE患者相对非SAE患者的异常基因表达。功能富集分析表明DEGs主要与突触前膜、细胞颗粒和外泌体相关，并涉及炎症反应、组织损伤、细胞代谢和免疫调节通路。SFTSV感染引发的炎症反应对宿主是一把双刃剑，过度炎症导致促炎细胞因子过量产生和免疫过度激活，最终导致器官功能障碍。既往研究表明SFTSV可侵入CNS并可能诱导免疫病理损伤，小鼠模型证实SFTSV可感染A1反应性星形胶质细胞，在大脑中复制，随后引发神经炎症和脑损伤。本研究结果强烈支持这些观察，表明SAE发生可能与不同个体免疫病理损伤程度相关。

GSEA分析显示非脑炎组细胞颗粒相关基因显著下调，这些基因参与病原体感染、炎症调节和信号转导。脑炎组细胞增殖和细胞应激相关通路显著上调，可能与SFTSV感染诱导的CNS损伤和MODS相关。免疫细胞扰动模式显示SFTSV感染通过抑制宿主免疫细胞功能同时引发过度炎症反应破坏免疫稳态，这种免疫失调以早期抗病毒免疫抑制和随后细胞因子风暴为特征，加剧病理损伤。有趣的是，免疫浸润分析显示两组免疫细胞组成相似，静息记忆T细胞和静息NK细胞占主导，此现象可能反映SFTSV感染驱动的免疫抑制和逃避机制。

通过免疫基因和ISGs分析，研究团队鉴定出六个关键基因：MET、KIT、IL1R2、MAFF、CD69和CEBPD，这些基因在调节细胞增殖、分化、免疫调节和干扰素信号通路中起关键作用。MET编码受体酪氨酸激酶，其扩增与STING表达减少相关，损害干扰素反应并抑制抗肿瘤免疫。KIT是另一种对细胞存活和增殖至关重要的受体酪氨酸激酶。IL1R2编码白细胞介素-1受体2，作为IL-1受体的拮抗剂，抑制IL-1诱导的炎症反应。脑炎组IL1R2表达降低可能解除对IL-1信号通路的负调控，导致过度炎症。MAFF是一种转录因子，与某些癌症中的炎症反应和免疫细胞浸润相关。CD69在多种免疫细胞中表达，证据表明CD69增强T细胞、B细胞和NK细胞的活化和细胞因子分泌，此外可能通过调节血管性血友病因子促进小鼠脑血栓形成。CEBPD编码参与分化和炎症的转录因子，可诱导星形胶质细胞分泌因子表达，影响神经元凋亡和炎症。这些基因表达谱为脑炎发病机制提供新分子见解，受体酪氨酸激酶信号异常激活可能驱动神经免疫细胞异常增殖，而干扰素反应失衡和炎症控制失调可能共同破坏CNS免疫稳态。

研究存在若干局限性：因获取SAE患者临床样本困难，转录组测序样本量相对有限，可能影响差异基因表达筛选和功能富集分析的统计效能，需扩大队列验证结果。缺乏匹配健康对照组，因现有SFTS数据集基线特征不同且无SAE数据，无法进行公共数据交叉验证。未来研究将通过扩大样本量、纳入未感染对照和使用定量实时PCR独立验证来弥补此限制。此外，本研究主要依赖生物信息学预测和统计分析，缺乏关键基因机制的体外或体内实验验证，限制了对所涉及致病机制的更深入理解。测序数据主要来自单时间点样本采集，限制了对免疫反应和疾病进展的动态评估，需纵向队列研究以更好地了解疾病进展过程中宿主免疫反应与疾病严重程度的相互作用。

总之，本研究结果为理解SAE发病机制提供了潜在研究靶点，强调了免疫微环境失调在SFTS诱导神经损伤中的潜在作用。研究将有助于更广泛地理解SFTSV发病机制，并可能为开发针对性干预措施以改善伴CNS受累的SFTS患者结局铺平道路。

ACKNOWLEDGMENTS

本研究得到国家重点研发计划（2023YFC2309100）、严重人畜共患传染病诊断与治疗国家重点实验室（2024KF10013）、南京大学中药研究所项目（ICM2024019）和江苏省杰出青年科学基金（BK20250016）支持。