验证Luedemann假说：从营养贫瘠环境中的慢生长微生物中发现新型抗菌药物（Pyocyanin A）及其对鲍曼不动杆菌的选择性杀菌机制研究

本研究发现营养贫瘠环境中生长的慢生长微生物是新型微生物物种和抗菌剂的宝贵来源。研究团队从Luedemann保藏库中筛选出147株菌，通过16S rRNA和全基因组测序（WGS）鉴定出多个新物种，并发现至少6株可产生对ESKAPE病原体（如鲍曼不动杆菌）具有活性的新型抗菌剂。其中菌株9005BA产生的新型吩嗪类化合物Pyocyanin A（C13H10N2O2，MIC=0.625 μg/mL）通过氧化应激机制发挥强效杀菌作用，且在动物模型中有效，为耐药菌感染提供了新的治疗策略。

　　

ABSTRACT

George Luedemann是抗菌剂研究领域中以发现庆大霉素而闻名的科学家。他提出假说认为，生活在恶劣、营养贫瘠环境中的慢生长微生物可能是未被描述的微生物物种的丰富来源，这些微生物通过产生新型抗菌剂以获得对快速生长竞争者的优势。本研究从沙漠岩石表面分离的750株慢生长微生物中，对前147株进行了表征和抗菌筛选。16S rRNA和全基因组测序显示，这批试点菌株组具有高度多样性，并包含了属于常见土壤样本相关属（如Geodermatophilus、Streptomyces和Micromonospora）的新微生物物种。抗菌筛选和比较基因组学表明，至少有6个成员可能产生对ESKAPE病原体、霍乱弧菌和/或耻垢分枝杆菌有活性的新型抗菌剂。特别地，库成员“9005BA”产生了一种新发现的吩嗪类化合物——Pyocyanin A，该化合物对鲍曼不动杆菌具有强效（0.625 μg/mL）和选择性的杀菌活性，并在动物模型中显示疗效。遗传和生化分析表明，Pyocyanin A的抗菌活性可能通过氧化应激介导，并可通过改变细菌呼吸和/或外排来克服。这些数据共同表明，生活在营养贫瘠环境中的慢生长微生物代表了以前被忽视的微生物和抗菌剂多样性的丰富来源。

IMPORTANCE

新型细菌物种的发现和研究为识别新的微生物生物学过程、分子机制和次级代谢产物（如新抗生素）提供了机会。我们的工作表明，生活在营养贫瘠环境中的慢生长微生物可能是新型微生物物种的丰富来源。此外，我们发现这些微生物中的一部分可能产生相应的新型抗菌剂，推测这是为了在竞争中胜过快速生长的对手。确实，我们发现一个推定的新链霉菌物种能够产生先前未描述的抗菌剂Pyocyanin A，该化合物对鲍曼不动杆菌（抗生素耐药性感染的主要原因）具有强效和选择性的抗菌活性。

INTRODUCTION

抗菌药物耐药性（AMR）是全球医疗危机。仅2019年，全球就有124万死亡归因于AMR感染，预计到2050年，这类感染将超过癌症成为全球年度死亡原因。六种细菌物种，称为ESKAPE病原体（粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和肠杆菌属），尤其成问题，因为它们是美国医院感染的主要原因，并且由于AMR而“逃避”一线抗生素的抗菌作用。虽然AMR对ESKAPE和其他病原体（如结核分枝杆菌）来说是一个长期问题，但耐多药抗生素耐药性也在非结核分枝杆菌、霍乱弧菌和其他生物中迅速出现，强调了需要新的抗生素来治疗细菌感染。

大多数抗生素是环境微生物天然产生的化学物质或其半合成衍生物，推测是为了创造对竞争微生物的优势。在这方面，抗生素药物发现的黄金时代始于20世纪40年代Waksman及其同事从土壤中的链霉菌中分离出天然产物抗生素放线菌素、链丝菌素和链霉素。由此产生的Waksman平台，即繁殖和分离相对容易培养的土壤微生物产生的新型抗菌剂，导致了对链霉菌的强烈天然产物探索，并产生了今天80%的抗生素。遵循这种方法，Luedemann及其同事将Waksman平台扩展到包括土壤中的小单孢菌，并开发了现代医学中最成功使用的抗生素之一——庆大霉素。虽然非常成功，但这种土壤衍生的天然产物抗菌探索最终开始导致重新发现已识别的抗生素。这，加上FDA监管的可变性和无效的抗生素研究倡导活动，随后导致大多数制药抗菌发现团队的缩减或完全取消。

退休到美国西南部后，Luedemann博士提出了一个假说，即生活在恶劣、营养贫瘠环境中的慢生长微生物可能产生抗菌剂以获得对快速生长生物的优势。此外，他预测，由于大多数先前的天然产物发现活动专注于快速生长、易于培养的环境生物，慢生长生物可能代表了一个以前未被认识和未开发的微生物及相应天然产物抗菌多样性的来源。为了检验这一假说，Luedemann博士收集并存档了大约750株慢生长微生物；然而，他在2000年去世前未能测试这些微生物是否产生新的抗菌剂的基本假说。我们获得了这个细菌菌株库，称为“Luedemann收藏”。在这里，我们描述了Luedemann收藏前147个成员的表征，以及发现了一种新的吩嗪抗菌化合物，该化合物对ESKAPE病原体鲍曼不动杆菌具有选择性、强效的抗菌活性，为“Luedemann假说”提供了初步验证。

RESULTS AND DISCUSSION

Luedemann collection

为了评估收藏的微生物组成，每个成员的16S rRNA序列被确定并与NCBI数据库使用BLAST进行比较。虽然并非所有成员的测序结果都成功获得，但125个分离株被发现与细菌NCBI条目共享94.8%–100%的16S rRNA序列同一性。相似性搜索调查显示，收藏的大部分（81.6%）由属于放线菌纲的五个属组成，这些属通常与土壤或岩石表面相关。这些包括6个Blastococcus spp.分离株、57个Geodermatophilus spp.分离株、35个Micromonospora spp.分离株、3个Modestobacter spp.分离株和5个Streptomyces spp.分离株。该收藏还包括一个较少从环境样本中分离的放线菌属（Nonomuraea spp.；四个分离株），以及来自其他各种细菌属的一到五个分离株。

虽然16S rRNA比较容易预测每个分离株的细菌属，但在物种水平上与NCBI条目的百分比同一性有所不同。因此，我们使用16S rRNA百分比同一性截断值≤98.65%作为新物种的预测指标，进一步评估了收藏包含新细菌物种的可能性。认识到低分辨率的16S rRNA测序数据可能人为预测低序列同一性，研究仅限于那些具有最高16S rRNA测序质量的分离株，以增加我们分析的完整性，这定义为对于大于1300碱基对的16S rRNA读长，高质量（Phred分数为40）≥90%。总共有91个分离株满足这些序列质量要求。其中，80个（87.9%）表现出与已知细菌物种≥98.65%的16S rRNA序列同一性。相反，11个（12.1%）Luedemann收藏成员表现出与NCBI中任何已知细菌物种小于98.65%的16S rRNA序列同一性，表明它们是新鉴定的细菌物种。这些新的推定物种包括五个Geodermatophilus分离株（G163、G249、G252、G254和G263）、一个Nonomuraea分离株（9132A）、一个Modestobacter分离株（G182）、一个Streptomyces分离株（9184C）、一个Blastococcus分离株（G155）和两个Micromonospora分离株（9165J和9196D）。确实，将每个这些分离株的多样性与每个属的参考NCBI 16S rRNA物种序列进行比较的系统发育树表明了明显的遗传距离，表明是新物种。

为了验证（或否定）这11个生物是新物种，进行了全基因组测序（WGS），并与NCBI细菌基因组条目进行了比较，使用平均核苷酸同一性（ANI）截断值≤95%作为新物种指定的共识阈值。一个分离株无法获得质量测序数据，而10个生物获得了质量基因组序列，其中8个与任何公开可用的基因组共享小于95%的同一性，表明它们是新的细菌物种。更直接地，G155、G163和G263分别与Geodermatophilus siccatus的ANI为90.9%、92.2%和94.2%，而G249和G252分别与Geodermatophilus bullaregiensis的ANI为89.7%和89.7%，G254与Geodermatophilus daqingensis共享86.1%的ANI，表明它们是新的Geodermatophilus物种。9165J可能是一个新的Micromonospora物种，与Micromonospora costi的ANI为89.9%，而G182是一个可能的新Modestobacter物种，最接近的ANI仅为85.9%。

因为我们研究的目标是评估收藏产生新型抗菌剂的能力，我们试图了解属于已知细菌物种的成员是否表现出种内多样性，而不是代表多次收集的相同菌株。相应地，比较了属于已知细菌物种的80个Luedemann收藏成员的16S rRNA和菌落形态。比较揭示了相当大的种内变异性。更直接地，50个（62.5%）成员的16S rRNA彼此不同，包括所有属于Micromonospora cremea（两个分离株）、Geodermatophilus nigrescens（两个分离株）、Geodermatophilus tziadensis（两个分离株）和Trujillonella endophytica（三个分离株）的分离株，表明它们不是克隆的。同样，在大多数属于Geodermatophilus normandii（12个分离株）、Geodermatophilus obscurus（6个分离株）和Modestobacter altitudinis（4个分离株）的分离株中也存在相当大的种内16S rRNA多样性。相反，总共有30个（37.5%）收藏成员似乎与同一物种的另一个条目具有相同的16S rRNA序列，包括所有Micromonospora eschinospora（四个分离株）、Micromonospora fluostatini（三个分离株）、Micromonospora saelicesensis（两个分离株）、Micromonospora soli（七个分离株）和Priesta flexa（两个分离株）的成员，以及大多数属于Micromonospora chaiyaphumensis（两个分离株）、Micromonospora soli（七个分离株）、G. siccatus（四个分离株）和Blastococcus（四个分离株）的分离株。然而，在大多数情况下，共享相同16S rRNA序列的菌株的菌落形态在颜色、形状和大小上 vastly不同，表明尽管16S rRNA测序表明克隆性，但在其遗传组成和/或表达特性上存在明显的菌株间差异，这些差异无法仅通过16S rRNA分析测量。

总之，试点Luedemann收藏子集的比较基因组学表明，它可能包括至少八个新细菌物种，并且在属于先前记录的细菌物种的分离株中具有明显的遗传和/或形态多样性。因此，我们着手确定收藏的整个成员是否能够产生天然产物抗菌剂。值得注意的是，如下所述，对表现出低16S rRNA序列质量因此未包括在上述分析中的感兴趣成员的全基因组测序表明，该收藏至少还包括另外八个新物种。

Antimicrobial screen

认识到抗菌天然产物可能随着生长阶段或内源性和/或外源性线索而暂时表达，每个Luedemann分离株在四种不同温度和/或生长条件下在营养有限的培养基中培养：（i）24°C，（ii）30°C，（iii）30°C存在热灭活的鲍曼不动杆菌，和（iv）37°C，总共7天。从每个成员和每个培养条件在孵育的第1、3和7天收集微生物上清液，并点接种到鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌、脓肿分枝杆菌、耻垢分枝杆菌和霍乱弧菌的菌苔上，以确定任何样品是否对这些生物中的任何一者显示抗菌特性。

Luedemann收藏成员9005BA的代表性筛选结果如图2A所示。对于9005BA，只有在25°C或30°C生长7天收集的上清液，以及在较小程度上37°C收集的上清液抑制了鲍曼不动杆菌的生长，而在25°C任何时间点收集的上清液或30°C生长1天后收集的上清液对金黄色葡萄球菌显示抗菌特性。在其他采样条件下收集的9005BA上清液未能影响鲍曼不动杆菌或金黄色葡萄球菌的生长，并且收集的任何上清液都不影响铜绿假单胞菌的生长（或测试的其他生物；未显示）。有趣的是，在营养丰富的培养条件下重复研究未能检测到对任何测试细菌物种的任何抗菌活性（未显示），表明9005BA能够在营养有限条件下生长期间暂时产生至少一种抗菌剂。

整个收藏的1,764个Luedemann上清液（147个分离株×四个生长条件×三个时间点）对每个测试生物的筛选结果总结在表1中。除了9005BA，来自12个（8.2%）其他Luedemann分离株的上清液对至少一个测试细菌物种产生了强大的生长抑制区。四个分离株对单一生物产生抑制区，五个对两种生物产生抑制区，四个对三种细菌物种产生抑制区。十一个上清液对金黄色葡萄球菌和/或霍乱弧菌有活性，五个对鲍曼不动杆菌和/或大肠杆菌有活性，三个Luedemann分离株的上清液对耻垢分枝杆菌有活性。在这些测定条件下，没有分离株上清液显示对脓肿分枝杆菌或铜绿假单胞菌的抗菌活性。

Enriching for organisms that produce novel antimicrobial agents

天然产物抗菌筛选程序的一个警告是重新发现已识别的抗生素。因此，作为初步步骤，以富集可能产生新型抗菌剂的Luedemann分离株，每个13个抗菌上清液重新测试对我们在储存库中的抗生素耐药菌株的抗菌活性。我们预测，如果一个上清液对给定的抗生素耐药菌株显示抗菌性能丧失，那么该上清液的抗菌特性可能（i）受该抗生素调节或（ii）被常见的抗菌耐药决定因子灭活，因此没有治疗前景。

为了测试，每个对金黄色葡萄球菌显示抗菌活性的九个上清液重新测试对耐链霉素、红霉素、利福平、四环素、磷霉素、albocycline或苯唑西林的金黄色葡萄球菌菌株的活性。对鲍曼不动杆菌有活性的五个上清液重新测试对具有四环素或利福平耐药性的菌株的生长抑制。代表性筛选结果显示在补充图S1A中，而每个上清液的汇编数据显示在表2中。筛选显示，来自9202F OW 1-21-92的上清液对耐四环素的金黄色葡萄球菌失去活性，9132I 11-23-91对耐红霉素、利福平或四环素的细菌菌株失去活性，9074 11-6-91对耐万古霉素的金黄色葡萄球菌（VRSA）失去活性。因此，我们降低了对这些Luedemann收藏分离株的优先级。相反，六个Luedemann收藏分离株，9005BA 1-8-04、9202FW 1-21-92、9176P 1-21-92、G192 6-19-94、9027 11-6-91和GdB 12-21-91，保留了对所有抗生素耐药菌株的抗菌活性，并被优先进行进一步测试。值得注意的是，M179 6-19-94、PAIL-27和PAIL-28未评估对耐药霍乱弧菌菌株的活性，并且也被携带进行进一步表征。

Whole-genome sequencing

WGS被用作更明确的手段来确定九个最高优先级的Luedemann分离株的抗菌性能是否可能由一种新型抗菌剂介导，同时更好地定义高优先级分离株的系统发育。为此，每个生物的基因组通过antiSMASH分析以确定它们是否携带已知的天然产物抗菌生物合成基因簇（BGCs），并通过GTDB-Tk更好地确定它们与已知细菌物种的亲缘关系。补充数据文件S4提供了每个优先级Luedemann分离株的antiSMASH搜索结果。

分离株G192和PAIL-28的基因组与antiSMASH数据库中的任何已知天然产物抗菌BGC没有相似性，表明在这些生物上清液中检测到的抗菌活性可能是由于一种以前未被认识的天然产物抗菌剂。同样，虽然发现三个分离株PAIL-27、9027和9202FW含有与已知抗菌BGC相似的基因，但与这些已知抗生素生物合成基因簇的相似性相对较低。此外，PAIL-27、9027和9202FW上清液的抗菌特性与那些已知生物合成基因簇产生的抗生素的活性不匹配，表明它们产生新型抗菌剂。更直接地，PAIL-27含有一个与tirandamycin（RNA聚合酶抑制剂）生物合成簇有80%相似性的基因簇，表明该生物可能能够产生tirandamycin样分子。然而，tirandamycin对革兰氏阳性物种有活性，而PAIL-27上清液仅对霍乱弧菌和鲍曼不动杆菌（后者不一致）有活性，两者都是革兰氏阴性生物，表明PAIL-27上清液中的抗菌剂不太可能由tirandamycin样支架介导。类似地，9027含有一个与合成filipin（一种抗真菌多烯大环内酯）的机器有84%相似性的基因簇。然而，在这些研究中收集的9027上清液不显示抗真菌活性（数据未显示）。同样，9202FW的基因组包含与短杆菌肽和酪rocidine生物合成基因簇分别有91%和81%组成相似性的基因簇。两者都是已知影响革兰氏阳性和阴性细菌物种的抗菌肽，但对分枝杆菌没有明显的活性，而9202FW上清液显示强大的抗分枝杆菌活性。

三个优先级的Luedemann分离株，9005BA、9176P和M179，含有显示100%相似性与已知抗菌BGC的基因簇。更具体地说，antiSMASH显示9005BA基因组含有与??-聚-L-赖氨酸机器100%相似性的基因，这是一种对铜绿假单胞菌有抗菌活性的抗菌剂。然而，我们推断9005BA上清液中的抗菌剂不太可能归因于??-聚-L-赖氨酸，因为我们的筛选并未表明9005BA上清液对铜绿假单胞菌有抗菌活性。确实，使用增加浓度的9005BA上清液的MIC测试证实，虽然它含有对鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌有抗菌功效的药剂，但上清液对铜绿假单胞菌没有可观察到的活性。9176P含有分别与柚皮素和??-聚-L-赖氨酸生物合成基因簇100%相似的基因。我们推断9176P上清液中的抗菌活性，对革兰氏阳性（金黄色葡萄球菌）和阴性（霍乱弧菌）细菌都有活性，不太可能归因于??-聚-L-赖氨酸的存在，因为该药剂对铜绿假单胞菌高度活跃，但上清液不是。然而，该生物的抗菌剂可能是由于产生柚皮素，一种已知对革兰氏阳性和阴性物种都显示抗菌活性的三羟基黄烷酮。同样，M179仅对霍乱弧菌显示抗菌活性，含有与bicornutin的BGC 100%相似性的基因，该化合物对另一种革兰氏阴性生物Erwinia amylovora有强效活性。因此，可以想象M179上清液的抗菌效应可能归因于bicornutin。

因为九个高优先级分离株的16S rRNA序列低于准确评估它们与其他细菌序列亲缘关系所需的序列质量阈值（90%高质量），它们未包括在上述16S rRNA分析中。因此，我们也使用它们的全基因组测序结果来更好地评估每个分离株的系统发育。为此，每个分离株的ANI与基因组分类学数据库条目（撰写时有596,859个基因组）进行了比较，ANI <95%截断值表示一个新物种。这一分析显示PAIL27可能是一株Streptomyces radiopugnans，平均核苷酸同一性为95.0%，而其余八个高优先级分离株可能代表新的细菌物种。更具体地说，PAIL-28、9005BA、9027、9132I和9176P可能构成新的链霉菌物种，显示与Streptomyces taklimakanensis（90.7% ANI）、Streptomyces mobaraensis（91.5% ANI）、Streptomyces nondiastaticus（92.6% ANI）、Streptomyces africanus（94.5% ANI）和Streptomyces specialis（89.3% ANI）最接近的基因组同一性。分离株G192、9177I和M179被发现与Micromonospora purpureochromogenes（92.8% ANI）、Micromonospora citrea（92.6% ANI）和Micromonospora peucetia（92.6% ANI）表现出最接近的基因组同一性，表明它们可能是新的小单孢菌物种。

总之，我们的结果表明PAIL-28、9005BA、9027、9132I、9176P、G192、M179和9177I是新的细菌物种。其中，我们得出结论，9176P和M179上清液的抗菌活性可能归因于已知的天然产物抗菌剂柚皮素和bicornutin，而其他分离株的活性可能归因于一种新型抗菌剂。为此，我们观察到9005BA的抗菌性能与深紫色色素的生产直接相关，并认为这种表型可能有助于快速定义该生物的抗菌剂。

Isolation and identification of the antimicrobial agent, compound 1

为了化学定义链霉菌 sp. 菌株9005BA产生的抗菌剂，通过单独筛选250个单独菌落，选择了一个过生产者菌株9005BA+，该菌株在30°C生长5天后产生对鲍曼不动杆菌具有增加抗菌活性的上清液（未显示）。9005BA+在小规模中生长以产生足够的材料，允许按照补充图S2A所示的方案对9005BA+上清液进行高效液相色谱（HPLC）分馏，HPLC-DAD（二极管阵列检测）数据显示在补充图S3A中。所有馏分都评估了对鲍曼不动杆菌的抗菌活性，并独立评估了对金黄色葡萄球菌的活性。虽然没有馏分显示对金黄色葡萄球菌有明显的活性，但两个馏分C6和C7消除了鲍曼不动杆菌的生长。质谱测定两个馏分都包含一个单一的m/z 227.08 [M + H]⁺峰，该峰与强效的抗不动杆菌活性相对应。为了促进回收更大量的活性剂以进行进一步的抗菌测试和结构解析，开发了按比例放大的抗菌分离方案。分离出的活性剂化合物1代表了干燥的9005BA+上清液（24.0 g）的0.05%产率（12.3 mg）。

化合物1被分离为一种深蓝色色素，并证实对鲍曼不动杆菌具有强效活性。对于1的结构解析，进行了紫外-可见光谱、高分辨率电喷雾电离质谱（HRESIMS）、一维和二维核磁共振（NMR）光谱以及单晶X射线晶体学实验。结果共同揭示了1的分子式为C₁₃H₁₀N₂O₂，通过HRESIMS（m/z 227.0826 [M + H]⁺，计算值C₁₃H₁₁N₂O₂为227.0810），具有10个不饱和度。其DAD光谱显示最大吸收在271、318、371、458和785 nm，表明存在一个长共轭系统。1H 1D、13C 1D、1H-1H COSY、编辑的异核单量子相干（HSQC）和异核多键相关（HMBC）光谱揭示，1以两种形式存在，1a（带正电荷形式）和1b（N-去甲基化形式），在甲醇-d₄溶剂系统中。

更直接地，1H NMR表明1a包含两个对称的1,2,3-三取代芳环（δ_H 7.87 [t, J = 8.4 Hz], 6.89 [d, J = 8.0 Hz], 和 6.75 [d, J = 8.4 Hz]）和一个N-甲基质子[δ_H 4.14, s]，而1b由两个对称的1,2,3-三取代芳环（δ_H 7.78 [t, J = 8.1 Hz], 7.61 [d, J = 8.7 Hz], 和 7.13 [d, J = 7.5 Hz]）组成。1H–1H 2D NMR同核COSY光谱支持了结构1a和1b中各个环内的这些交叉峰相关性。比较1a和1b芳环系统中质子的积分值，计算出的存在比例为1a占73.24%，1b占26.76%。

1a和1b的结构基于HMBC实验建立。更直接地，观察到的1H-1H COSY和HMBC相关性分别用粗线和箭头标记在图4中，对应结构1a和1b。在1a中，H-7（δ_H 7.87）和C-9（δ_c 170.30）之间的强HMBC相关性，连同H-8（δ_H 6.75）和C-9（δ_c 170.30）之间的弱相关性，表明C-9碳的位置。来自H-8（δ_H 6.75）和H-6（δ_H 6.89）到C-9a（δ_c 136.95）的HMBC相关性揭示了C-9a碳位于C-9（δ_c 170.30）旁边。来自H-7（δ_H 7.86）和5-CH₃的甲基质子（δ_H 4.14）到C-5a（δ_c 136.27）的HMBC相关性揭示了C-5a碳的位置。在1b中，H-7（δ_H 7.78）和C-9（δ_c 156.22）之间的强HMBC相关性，连同H-8（δ_H 7.13）和C-9（δ_c 156.22）之间的弱相关性，表明C-9 bearing a hydroxy group的位置。来自H-8（δ_H 7.13）和H-6（δ_H 7.61）到C-9a（δ_c 135.41）的HMBC相关性揭示了C-9a碳位于C-9（δ_c 156.22）旁边。来自H-7（δ_H 7.78）到C-5a（δ