金黄色葡萄球菌ST188谱系的特异性适应与全球传播及耐多药MRSA亚谱系的出现

本研究通过对全球24个国家808株金黄色葡萄球菌ST188菌株进行系统基因组分析，揭示了该谱系通过获得SCCmec IVa元件及Tn6636转座子进化出耐多药MRSA亚谱系的机制，发现其伴随毒力基因（sraP/splDE）丢失导致的定植能力减弱，为理解传统敏感谱系进化出多重耐药性提供了关键进化生物学证据。

　　

ABSTRACT

金黄色葡萄球菌序列型（ST）188是一种全球分布的谱系，频繁与人类和动物的定植及血流感染相关，但其进化动力学和基因组适应机制尚未明确。本研究对2004至2023年间从24个国家收集的808株ST188分离株进行了全面基因组分析。系统发育重建识别出七个进化枝，其中进化枝I和VII在中国呈现独立的克隆扩张。研究观察到频繁的跨区域、国际和跨宿主传播事件，支持ST188作为宿主通用型谱系的出现。进化枝VI内一个独特的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）亚枝可能通过获得SCC_mec IVa从甲氧西林敏感祖先演化而来，该事件同时伴随耐药转座子Tn₆₆₃₆和氟喹诺酮耐药突变的共获得，以及粘附相关基因sraP的截断和丝氨酸蛋白酶基因splDE的丢失。初步表型实验证实进化枝VI分离株的粘附和定植能力降低。比较分析揭示了移动遗传元件（MGE）的进化枝特异性模式，包括进化枝VII中国亚枝中SaPI1和SaPI2的垂直遗传。相比之下，仅在进化枝VII分离株中发现的新型前噬菌体φST188-1可能为独立获得。然而，各进化枝的附属基因组变异有限，整体种群结构主要由核心基因组单核苷酸多态性（SNP）驱动。这些发现为ST188的进化和适应提供了详细见解，强调了进化枝特异性耐药和毒力模式的作用，并凸显了持续基因组监测对这一新兴谱系的重要性。

INTRODUCTION

金黄色葡萄球菌是常见的人类定植菌，也是全球最重要的机会性细菌病原体之一，常与严重侵袭性感染相关。作为具有漫长进化史的多宿主机会病原体，该菌持续定植于约30%人类前鼻孔，并可能存在于皮肤、咽喉、腋窝和会阴区域。虽然定植通常无症状，但显著增加感染风险。研究表明高达80%感染病例中的致病菌株与定植菌株基因一致。当皮肤或黏膜屏障因慢性皮肤病、伤口或手术程序受损时，金黄色葡萄球菌可侵入深层组织或进入血流。携带侵入性医疗设备（如外周或中心静脉导管）或免疫功能低下患者尤其易感。

ST188谱系在健康个体和动物鼻腔中表现出高定植率，并能引起多种动物宿主感染。值得注意的是，它是与牛乳腺炎相关的最常见甲氧氧西林敏感金黄色葡萄球菌（MSSA）谱系之一。研究者假设ST188通过上调细菌粘附和生物膜形成相关因子获得了定植多样化宿主的能力。此外，特应性皮炎（AD）作为最常见的炎症性皮肤病之一，过去十年发病率显著上升，造成重大全球疾病负担。多项研究确定ST188是AD受累皮肤最常检测到的序列型（ST），其分离率和相对丰度随疾病严重程度显著增加。更重要的是，ST188在亚洲AD患者和AD发病前婴儿的分离株中占主导地位。更令人担忧的是，近期流行病学数据表明ST188已成为中国成人血流感染中最流行的MSSA谱系。虽然ST188 MRSA仍相对罕见，但根据Pathogenwatch的基因组监测数据，其已在北美、亚洲和澳大利亚等地理多样化区域被检测到，反映出全球分布特征。鉴于MSSA可通过获得葡萄球菌染色体盒mec（SCC_mec）元件成为MRSA出现的储库，这一现象尤为值得关注。尽管已有这些认识，大多数先前研究集中于ST188的流行病学特征，对其基因组进化和基因型特征的全面理解仍然缺乏。

本研究对2004至2023年全球收集的808株金黄色葡萄球菌ST188分离株进行了全面基因组分析，旨在阐明其种群结构、进化分化和关键基因组特征。通过系统发育重建追踪进化枝水平分化和跨区域或跨宿主传播，比较各进化枝的抗菌素耐药性（AMR）基因、毒力因子和移动遗传元件（MGE），并分析附属基因组内容与核心单核苷酸多态性（SNP）变异，揭示了ST188的进化动力学和谱系特异性适应。这些发现推进了我们对其多样化的理解，包括MRSA亚枝的出现，并为未来基因组监测和功能研究提供了宝贵框架。

MATERIALS AND METHODS

Collection of bacterial isolates

截至2024年7月，从NCBI GenBank数据库共检索85,893个金黄色葡萄球菌基因组组装。使用MLST v2.0网络工具分配ST类型，仅纳入具有可用地理和采集日期元数据的ST188分离株进行进一步分析。此外，前瞻性收集了2021至2023年间温州医科大学附属第二医院育英儿童医院常规临床护理患者血液、尿液、伤口/脓液和呼吸道标本中的29株ST188分离株（2株MRSA和27株MSSA）。根据美国疾病控制与预防中心定义，所有29株分离株被归类为社区获得性。使用VITEK-2系统（bioMérieux, France）对这些分离株进行抗菌药物敏感性试验。本研究共纳入2004至2023年间从五大洲24个国家收集的808株ST188分离株。

Whole-genome sequencing and genomic analysis of ST188 isolates

使用Ezup Column细菌基因组DNA纯化试剂盒（Sangon Biotech, 中国上海）提取29株ST188分离株的基因组DNA。在Illumina HiSeq X Ten平台（San Diego, CA, USA）上进行全基因组测序，读长为2×150 bp。使用fastp v0.23.2对原始读段进行修剪和质量过滤，使用SPAdes v3.13.0进行从头组装。使用Oxford Nanopore平台（Oxford Nanopore Technologies, UK）对代表性分离株M2024进行长读长测序。使用Unicycler v0.5.0结合长读长和Illumina短读长进行混合基因组组装，生成完整基因组序列。分别使用网络工具SCCmecFinder和SpaTyper进行SCC_mec和spa分型。使用DFAST v1.2.18进行基因组注释。使用Panaroo v1.3.0在严格模式下进行ST188分离株的泛基因组分析，将附属基因定义为存在率低于100%的基因。使用R语言Rtsne包对附属基因内容矩阵进行非线性降维。

Phylogenetic analysis and Bayesian evolutionary analysis

以参考基因组M2024（GenBank登录号CP195249.1）为基准，使用Snippy v4.6.0对808株ST188分离株进行核心基因组比对。在系统发育分析前，使用Gubbins v2.4.1识别并去除重组区域。使用RAxML v8.2.12在GTRGAMMAX模型下构建最大似然系统发育树，采用1,000次自举重复。以金黄色葡萄球菌MW2（ST1，登录号NC_003923）基因组作为外群。使用BactDating v1.1在mixedcarc模型下进行时间系统发育重建，进行2亿次MCMC迭代。通过所有参数有效样本量（ESS）>200确认收敛。使用ggtree v3.7.1.003可视化最终系统发育树，并用相应元数据注释。使用cytoscape v3.8.2可视化核心基因组SNP距离<24的克隆传播簇。使用Rtsne包对核心SNP矩阵进行非线性降维。

Identification of AMR genes, virulence genes, and MGEs among ST188 isolates

使用AMRFinderPlus v3.11.20识别AMR基因，而使用ABRicate v1.0.0基于VFDB数据库预测毒力因子，应用≥90%序列一致性和≥90%覆盖度的阈值。通过BLASTN使用公开可用的金黄色葡萄球菌MGE序列作为参考检测致病岛和前噬菌体，最低一致性和查询覆盖度为85%。使用gggenomes R包可视化MGE的线性比较。

Mice nasal colonization model

对每个测试菌株，一组五只小鼠（n=5）鼻内接种0.5麦氏浊度标准调整的10μL金黄色葡萄球菌细胞PBS悬液。在标准饲养条件下定植5天后，处死小鼠并无菌收集鼻组织匀浆。通过将200μL系列稀释匀浆液涂布于TSA平板定量细菌定植水平。

Adhesion assay

如先前描述评估不同进化枝菌株的粘附能力。将过夜细菌培养物调整至OD₆₀₀=0.5，然后与A549人肺泡上皮细胞在37°C、5% CO₂培养箱中孵育。共培养2小时后，用PBS洗涤去除非粘附细菌，随后使用0.1%脱氧胆酸钠裂解上皮细胞释放表面粘附和内化细菌进行计数。

Cytokine determination

在小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞中培养于高葡萄糖DMEM（Gibco, Thermo Fisher Scientific, USA），补充10%胎牛血清（FBS; Sigma-Aldrich, USA）和1%青霉素-链霉素（Thermo Fisher Scientific）。将细胞以3×10⁵细胞/mL密度接种于无菌六孔培养板（Corning, USA），在37°C、5% CO₂培养箱中孵育24小时。将细菌培养物在无菌PBS中调整至1.0×10⁹ CFU/mL。每孔加入10μL该悬液以达到30的感染复数。在37°C共培养6小时。孵育后，收集细胞培养上清并在4°C以2,000×g离心20分钟去除残留碎片。使用酶联免疫吸附测定试剂盒（R&D Systems, USA）按制造商方案测量清除上清中IL-6和TNF-α水平。

Whole-blood killing assay

在TSB中培养金黄色葡萄球菌菌株至后指数期。将细菌悬液制备为约2.5×10⁸ CFU并加入新鲜肝素化人全血。混合物在37°C连续旋转下孵育1小时。孵育后，样品系列稀释并涂布于TSA测定活菌计数。

Statistical analysis

所有数据处理和统计分析使用R软件（版本4.2）进行。分类变量以计数和百分比汇总，组间比较使用卡方检验或Fisher精确检验（如适用）。连续变量表示为均值±标准差，组间差异使用Wilcoxon秩和检验评估。双尾P值<0.05被认为具有统计学显著性。

RESULTS

Geographic distribution and evolutionary trajectory of the S. aureus ST188 isolates

为全面表征金黄色葡萄球菌ST188的全球分子进化模式，我们纳入了2004至2023年间从亚洲、欧洲、美洲、非洲和大洋洲24个国家收集的808株ST188分离株的全基因组组装。其中29株社区获得性分离株来自我们的收集。ST188的地理分布显示，中国分离株数量最多（53.84%，435/808），其次为日本（8.04%，65/808）、英国（7.18%，58/808）、美国（6.68%，54/808）和澳大利亚（5.82%，47/808）。值得注意的是，自2010年以来中国分离株在数据集中逐渐占主导地位。虽然大多数（89.48%，723/808）分离株为MSSA，但在横跨四大洲的10个国家共鉴定出85株MRSA分离株（包括13株来自中国），表明ST188 MRSA菌株具有显著地理多样性。重要的是，435株中国分离株来自21个不同省份，覆盖约76.22%全国人口（约11亿人），提示该谱系在中国广泛传播。

基于36,472个非重组核心SNP的系统基因组分析表明，所有ST188分离株的最晚共同祖先出现于约1954年（95%最高后验密度：1945–1962），随后不久分化为七个主要系统发育进化枝（I–VII），估计分化时间从1958年至1977年。这些发现表明ST188的全球传播已持续至少数十年。此外，系统发育分析证明中国ST188分离株源自多个谱系：除进化枝III和VI中的零星分离株外，进化枝I的所有分离株和进化枝VII中高达71.20%的分离株收集自中国，显示本地扩张。此外，进化枝IV内的分离株主要源自美国（63.16%），而进化枝V内的分离株主要源自日本（87.69%）。其他进化枝缺乏明显地理分布。值得注意的是，除三株ST188 MRSA分离株零星散布在系统发育树中，大多数MRSA分离株明显聚集在进化枝VI，可能源于1996年左右SCC_mec IVa的单一引入事件，形成独特MRSA亚枝。这些MRSA分离株与进化枝VI中基础MSSA分离株的密切系统发育关联进一步表明ST188 MRSA可能从祖先MSSA菌株演化而来。此外，虽然基因型spa分型在808株ST188分离株中鉴定出总共38种spa类型，但spa t189在所有进化枝中占主导地位，流行率从83.67%至93.33%不等。

尽管来自同一国家的某些分离株在系统发育树上形成紧密簇，但除进化枝I外，所有进化枝中来自不同国家甚至大洲的分离株聚集在一起，中国不同省份的分离株在中国境内没有明确地理边界。有趣的是，虽然绝大多数分离株为人源，但其余49株分离株源自12种不同宿主来源，覆盖食物（n=13）、动物（n=29）、环境（n=6）和植物（n=1）。系统发育分析显示这些非人源分离株分散在整个树中，并与相邻人源分离株密切相关。此外，成对SNP差异表明不同进化枝分离株间的核心基因组SNP变异范围为155至347（中位数=241），提示主要进化枝间存在显著遗传分化。使用少于24个SNP差异作为指示金黄色葡萄球菌可能参与克隆传播事件的阈值，我们识别出11个国家78个独立克隆传播事件，包括美国和加拿大之间的国际传播，以及中国农场涉及猪、农场工人和环境的传播事件。此外，在中国识别的31个小规模传播事件跨越14个不同省份，包括三个省际传播事件。

Distributions of AMR genes in the ST188 lineage

为研究全球ST188分离株的AMR谱，我们评估了不同系统发育进化枝中耐药基因和染色体突变的分布。总共鉴定出38个耐药基因，赋予对15类抗生素的耐药性。值得注意的是，进化枝VI内的分离株携带中位数七个耐药基因，显著高于所有其他进化枝（中位数范围：0–1）。进一步分析显示进化枝VI分离株频繁携带氨基糖苷类耐药基因aac(6′)-aph(2″)（84.62%）、大环内酯类耐药基因erm(B)（83.76%）和甲氧苄啶耐药基因dfrE（84.62%），所有这些基因流行率均显著高于其他进化枝。值得注意的是，这些基因共定位于复合转座子Tn₆₆₃₆内。此外，氟喹诺酮耐药相关突变grlA S80F（89.74%）和gyrA S84L（89.74%）也在进化枝VI中高度富集。这些耐药分离株主要属于进化枝VI内的MRSA亚枝及其密切相关的MSSA对应株，进一步支持携带SCC_mec IVa的ST188 MRSA可能从甲氧西林敏感祖先ST188菌株进化而来的假设。

β-内酰胺酶基因blaZ在除进化枝IV和V外的所有进化枝中超过84%分离株中发现，其流行率在这些进化枝中分别降至50%和13.85%。具体而言，进化枝IV中63.15%的blaZ阴性分离株来自美国，而进化枝V中87.72%的blaZ阴性分离株来自日本，提示特定谱系中青霉素敏感性可能呈趋势。此外，进化枝I中超过24%的分离株携带大环内酯类耐药基因erm(C)和甲氧苄啶耐药基因dfrG，这两种基因在其他进化枝中的流行率均低于12%。此外，其余耐药基因在ST188谱系中零星分布，所有进化枝中总体流行率较低（<16%）。

我们还评估了我们收集中29株中国ST188分离株对15种常用抗生素的体外敏感性。结果表明预测的耐药基因型与观察到的抗菌药物敏感性模式之间存在强相关性。

Comparison of virulence genes in ST188 clades

为评估不同系统发育进化枝分离株的致病潜力，我们使用VFDB数据库分析了全球ST188谱系中毒力因子的分布。在所有分离株中共鉴定出127个毒力基因，其中96个（75.59%）存在于所有进化枝超过90%的分离株中。这些基因覆盖与铁摄取、免疫逃避、粘附、酶、分泌系统、溶血素、酚溶性调节素、肠毒素和杀白细胞素相关的功能。值得注意的是，表现出最高水平AMR的进化枝VI分离株携带显著更少毒力基因（中位数=106），与进化枝I、II、IV和VII分离株（中位数分别为108、108、108和109）相比，但与进化枝III和V相似（两者中位数=106）。

具体而言，丝氨酸蛋白酶基因splD和splE仅在25.64%的进化枝VI分离株中检测到，显著低于其他进化枝（均>76.19%），这些基因丢失仅在VI的MRSA亚枝中观察到。肠毒素基因seb主要限于进化枝VII（27.4%），85.40%的seb阳性分离株来自中国。相比之下，seb在其他进化枝中很少检测到，流行率范围从0%至9.52%。虽然肠毒素基因sec和sell以及中毒性休克综合征毒素基因tsst-1在ST188谱系中通常不常见，但在42株中国分离株中鉴定到，其中88.10%属于进化枝VII。有趣的是，虽然 nearly all ST188分离株携带编码免疫逃避簇（IEC）的基因（762/808, 94.31%），但IEC类型的分布因进化枝而异。IEC类型E（sak-scn）在进化枝II、III、V和VI中占主导，而类型G（selp-sak-scn）在进化枝IV中占主导。相比之下，IEC类型B（sak-chp-scn）（包含趋化抑制蛋白基因chp）在进化枝I和VII中流行，分别占44.90%（22/49）和69.80%（349/500）分离株。重要的是，进化枝I中所有chp阳性分离株和进化枝VII中79.42%为中国来源。此外，Panton-Valentine杀白细胞素（PVL）基因和剥脱性毒素基因eta可分别在六株和两株ST188菌株中检测到。

鉴于ST188相关的强粘附能力，我们进行了不同系统发育进化枝粘附相关基因的详细分析。结果显示，除进化枝VI外，其他进化枝中大多数分离株携带野生型sraP基因（流行率范围57.14%至86.67%），该基因编码由N端信号肽（SP, 1–90 aa）、短丝氨酸丰富区（SRR1, 91–244 aa）、负责配体结合的非重复区（NRR, 245–751 aa）、长丝氨酸丰富区（SRR2, 752–2,225 aa）和C端细胞壁锚定基序（CW, 2,226–2,275 aa）组成的蛋白质。相比之下，88.03%（103/117）的进化枝VI分离株在SRR2结构域内表现出136个氨基酸的内部缺失。此类sraP截断仅在进化枝VI中的MRSA亚枝及其密切相关的MSSA分离株中观察到，提示这些结构改变可能降低进化枝VI分离株的粘附能力。

由于我们收集中分离株数量有限，包括4株来自进化枝I、2株来自进化枝VI和22株来自进化枝VII，我们选择所有可用进化枝I和VI分离株，以及随机选择4株进化枝VII分离株进行初步毒力评估。结果显示，与进化枝I和VII分离株相比，进化枝VI分离株表现出显著更低的小鼠鼻定植能力和上皮细胞粘附能力，为我们关于进化枝VI粘附减少的假设提供初步支持。此外，进化枝间致病性比较显示，进化枝VI分离株诱导较低炎症细胞因子（IL-6和TNF-α）表达水平，并在全血杀灭试验中显示较低存活率，相对其他两进化枝。相比之下，进化枝VII分离株表现出最高总体毒力潜力。

Comparison of MGE profiles among ST188 clades

水平基因转移通过促进遗传物质（尤其是MGE）交换，在塑造金黄色葡萄球菌基因组结构中起关键作用。为进一步探索这一方面，我们调查了所有ST188分离株中大MGE的分布，包括金黄色葡萄球菌致病岛（SaPIs）、基因组岛和前噬菌体。结果显示所有分离株携带基因组岛vSaα、vSaβ和vSaγ，并且每个进化枝中超过89%分离株含有前噬菌体φSa3。进化枝VII分离株包含显著更多MGEs，平均每分离株5.77个MGEs。这种较高MGE负载主要由于携带seb的SaPI1（27.20%，136/500分离株）和SaPI2（81.00%，405/500）流行率升高。进化枝VII中国亚枝中携带SaPI1或SaPI2的分离株形成单系簇，表明这些元件主要在该谱系内通过垂直传播扩散。虽然编码sec、sell和tsst-1的SaPI3以及前噬菌体φSa5和φSa7以低总体频率检测到，但阳性分离株分散在整个进化枝VII的中国亚枝中。

虽然所有ST188进化枝携带基因组岛vSaα和vSaβ，但我们观察到进化枝特异性结构变异。在进化枝III中，分离株频繁显示vSaβ内肠毒素基因簇丢失，仅46.67%（7/15）菌株保留完整基因簇。此外，在28株进化枝VII分离株（包括26株来自中国）的vSaβ内鉴定出一种新型前噬菌体，命名为φST188-1。该元件内未发现已知毒力基因。结构分析表明φST188-1与典型金黄色葡萄球菌前噬菌体共享模块化组织，由裂解模块、结构模块（尾、头和包装）、DNA复制和转录调控模块以及溶原性模块组成。值得注意的是，在进化枝VII中人源和环境源分离株中检测到高度相似φST188-1元件，提示该前噬菌体可能能够在不同宿主生态位间传播。对NCBI核苷酸数据库的BLASTN搜索显示φST188-1与五个公开可用金黄色葡萄球菌基因组中的序列相似性，比对覆盖度 above 78%且核苷酸一致性 above 95%。然而，系统发育分析表明进化枝VII中的φST188-1元件可能源自单一祖先获得事件。

此外，我们鉴定出104株携带φSa2的ST188分离株，其未在srrB基因下游常规位点整合，而是在替代基因组位点整合，包括在膜蛋白编码基因terC和丝氨酸蛋白酶基因htrA之间（n=88）、在膜蛋白基因MW1551和预测肠毒素基因MW1552之间（n=13）、在tRNA甲基转移酶基因trmL和环氧queuosine还原酶基因queG之间，以及 within 血红素转运透酶基因hrtB和粘附基因ebh的编码区。比较分析显示这些φSa2变体间的序列差异主要位于DNA复制和转录调控模块以及溶原性模块内。对整合在terC和htrA间φSa2变体的进一步分析显示阳性分离株零星分布在整个进化枝V（n=18）、VI（n=17）和VII（n=49）中。这表明这些φSa2变体可能被不同进化枝分离株独立获得。值得注意的是，进化枝VII中所有φSa2阳性分离株为中国来源。

Core SNPs significantly drove the evolution of the ST188 lineage

为探索ST188谱系不同进化枝间的遗传变异，我们进行了全面泛基因组分析。基于附属基因内容矩阵的t分布随机邻域嵌入（t-SNE）显示无 distinct 进化枝特异性聚类。来自不同进化枝的分离株 largely 混合且在二维空间中不可区分，表明附属基因组变异在ST188谱系中显示无清晰进化枝边界分离。虽然每个ST188进化枝包含一些独特附属基因，但总体比例非常有限。进化枝I–V仅携带0–1.39%进化枝特异性附属基因，而进化枝VI和VII携带略高比例（分别为4.31%和10.41%）。这表明，虽然进化枝特异性附属基因存在，但它们对ST188谱系多样化的贡献 minimal。类似地，进化枝间附属基因内容变异略大于进化枝内变异（中位数比率=1.39），远低于其他流行谱系如中国ST239中观察到的（中位数比率=3.85，数据未显示）。这些发现表明ST188进化枝间附属基因组成差异相对最小，遗传多样性在种群水平积累。

相比之下，基于核心SNP矩阵的t-SNE分析揭示了清晰进化枝特异性聚类模式，表明ST188谱系的进化主要由进化枝间核心基因组SNP变异驱动。使用Scoary进行的严格核心基因组范围关联分析鉴定出几个进化枝相关SNP，显著SNP数量范围从1至36。值得注意的是，这些进化枝特异性SNP中 several 与毒力相关基因相关，包括粘附基因（sasH、sasC和vWbp）、脂肪酶基因lip和VII型分泌系统相关基因essC。使用直系同源簇（COG）数据库对这些进化枝特异性SNP的功能注释揭示了“氨基酸和碳水化合物转运与代谢”类别中的富集。

DISCUSSION

理解流行金黄色葡萄球菌谱系的进化动力学和传播机制对于减轻其临床影响至关重要，特别是在新兴社区相关和 livestock-associated 菌株 increasingly 模糊传统流行病学边界的背景下。虽然多宿主定植ST188谱系尚未被描述为引起医院相关感染或社区相关感染的全球大流行菌株，但本研究中的808株ST188分离株从2004至2023年间从五大洲24个国家收集，甚至包括萨摩亚群岛等地理隔离区域，表明其全球传播可能被显著低估。此外，对ST188基因组架构和进化轨迹的全面理解仍然缺乏。深入表征其基因组流行病学和传播动力学对于有效感染控制至关重要。在此背景下，我们的研究为来自广泛全球收集的808株ST188分离株提供了全面基因组和进化框架。

我们的系统基因组分析显示全球ST188谱系已分化为七个 distinct 进化枝，中国分离株主要限于两个主要进化枝：进化枝I（包含100%中国菌株）和VII（71.20