3D打印功能化锶-丝素蛋白-羟基磷灰石支架通过免疫调节与序贯血管-成骨耦联促进骨再生

本研究针对大段骨缺损修复中血管化不足与免疫排斥难题，开发了EP@PCL/Sr多功能支架。通过锶掺杂羟基磷灰石（Sr-SF-HA）增强成血管/成骨活性，表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）涂层调控免疫微环境，证实该支架能通过ITGA10/PI3K/AKT通路促进BMSCs成骨分化，在体内外显著提升颅骨缺损修复效果，为骨组织工程提供了创新策略。

　　

大段骨缺损的修复一直是临床面临的重大挑战。虽然自体骨和异体骨移植是当前常用的治疗方法，但来源有限、应用受限等问题制约了其广泛应用。近年来，骨组织工程生物材料的发展为再生骨缺损提供了新思路，其中3D打印支架因其优异的个性化定制能力和高精度特性备受关注。然而，植入性生物材料在骨再生中的应用仍面临两大难题：一是缺乏有效的血管化，导致营养物质和氧气无法及时输送；二是内源性免疫排斥风险，可能引发炎症反应，阻碍骨愈合过程。这些病理生理微环境障碍严重影响了骨缺损的修复效果。

为了攻克这些难题，西南医科大学附属口腔医院口腔颌面外科的研究团队在《Bioactive Materials》上发表了一项创新研究。他们成功合成了一种多功能3D打印生物支架——EP@PCL/Sr，该支架能够在免疫微环境中实现分阶段血管化骨再生，显著促进骨缺损修复。

研究人员主要运用了以下关键技术方法：通过水热共沉淀法合成锶-丝素蛋白-羟基磷灰石纳米颗粒（Sr-SF-HA NPs）；采用熔融沉积成型3D打印技术制备聚己内酯（PCL）基复合支架；利用表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）和聚乙烯亚胺（PEI）通过层层自组装技术构建表面功能涂层；通过SD大鼠骨髓间充质干细胞（rBMSCs）、人脐静脉内皮细胞（HUVECs）和小鼠单核巨噬细胞（Raw264.7）开展体外功能验证；建立SD大鼠颅骨缺损模型进行体内修复效果评估。

2.1. Sr-SF-HA纳米颗粒和EP@PCL/Sr支架的合成与表征

研究人员首先以丝素蛋白为模板，通过仿生矿化合成了Sr-SF-HA颗粒。透射电镜显示颗粒呈均匀棒状结构，高分辨图像显示特征晶格间距与纯羟基磷灰石一致。能量色散谱 mapping证实Sr、Ca、N、P、O和C元素均匀分布在颗粒表面，X射线光电子能谱检测到Sr3d、Sr3p等特征峰。X射线衍射显示颗粒具有HAp晶体的特征衍射峰，傅里叶变换红外光谱检测到PO₄^3?基团的反伸缩振动和丝素蛋白的三个特征酰胺带，证实了Sr-SF-HA NPs的成功合成。

2.2. EP@PCL/Sr支架的生物相容性和细胞粘附性

生物相容性评估显示，三种支架提取物培养的细胞均保持稳定的增殖和生长趋势，未见死细胞。CCK-8检测表明，与对照组相比，不同支架提取物培养的细胞活力随时间增加，实验组间无显著差异。共聚焦显微镜观察发现，与PCL和PCL/Sr支架上常规纺锤形细胞相比，EP@PCL/Sr支架上的细胞呈现更伸展的形态，这可能是涂层粗糙表面促进了细胞附着。

2.3. EP@PCL/Sr支架在正常和免疫环境中显著促进成骨

在正常环境下，EP@PCL/Sr和PCL/Sr处理组的细胞在第7天显示更深的ALP染色，表明更强的成骨活性。第21天，ARS染色显示EP@PCL/Sr和PCL/Sr处理组的钙结节数量显著增加。qRT-PCR检测发现，EP@PCL/Sr和PCL/Sr处理组中ALP、OPN和RUNX2的基因表达显著高于PCL和CON组。免疫荧光染色显示，EP@PCL/Sr和PCL/Sr处理组的OPN和RUNX2表达显著更高。

在免疫环境下，EP@PCL/Sr处理组的细胞显示最深的ALP染色，而PCL/Sr处理组的染色较弱。第21天，EP@PCL/Sr组产生最多的钙结节。qRT-PCR显示，EP@PCL/Sr和PCL/Sr组的ALP、OPN和RUNX2基因表达显著增加，其中EP@PCL/Sr组的表达显著高于PCL/Sr组。免疫荧光染色显示，EP@PCL/Sr组的OPN和RUNX2表达最高。

2.4. EP@PCL/Sr支架通过ITGA10/PI3K/AKT通路显著增强BMSCs的成骨

RNA测序显示，EP@PCL/Sr通过调节"炎症反应"、"血管生成正调控"、"细胞外基质组织"和"成骨细胞分化"等生物过程促进BMSCs成骨。在细胞组分术语中，与成骨功能相关的PI3K/AKT信号、细胞外基质-受体相互作用和粘着斑通路也富集。Western blotting显示，EP@PCL/Sr组的p-PI3K和p-AKT蛋白水平显著高于PLC组，表明EP@PCL/Sr支架可能通过ITGA10/PI3K/AKT信号轴促进BMSCs的成骨。

2.5. EP@PCL/Sr支架在体外显著增强HUVECs的血管生成

划痕实验显示，PCL/Sr和EP@PCL/Sr组的细胞迁移距离显著长于CON和PCL组。管形成实验表明，PCL/Sr和EP@PCL/Sr组显示广泛完整的管状结构。qRT-PCR检测发现，PCL/Sr和EP@PCL/Sr支架提取物处理的HUVECs中CD31和VEGF基因表达在第1天和第3天显著增加。免疫荧光染色显示，PCL/Sr和EP@PCL/Sr组的VEGF蛋白表达显著更高，证实这两种支架，特别是EP@PCL/Sr支架，显著增强HUVECs的血管生成能力。

2.6. EP@PCL/Sr支架在体外具有优异的氧自由基清除活性

DPPH自由基清除实验显示，EP@PCL/Sr组溶液呈淡黄色，与阳性对照（VC处理组）相似，表明EP@PCL/Sr支架具有优异的氧自由基清除活性。UV光谱进一步证实了支架的抗氧化效果。细胞内ROS水平检测显示，阳性对照、PCL和PCL/Sr组细胞显示强荧光信号，而EP@PCL/Sr支架提取物处理的细胞荧光显著减弱，表明这些支架对细胞内ROS产生有 potent 抑制作用。

2.7. EP@PCL/Sr支架的体外免疫调节活性

流式细胞术分析显示，与阳性对照组（91.1%）相比，PCL处理组（89.5%）和PCL/Sr处理组（89.7%）的CD86阳性细胞比例相似，但EP@PCL/Sr处理组（57.5%）显著降低。相反，EP@PCL/Sr处理组（66.4%）的CD206阳性细胞数量显著高于阳性对照组（44.9%）、PCL处理组（42.6%）和PCL/Sr处理组（44.1%）。免疫荧光染色显示，PCL和PCL/Sr处理组的iNOS表达显著升高，而EP@PCL/Sr处理组的荧光强度显著降低。CD206染色显示，阳性对照、PCL和PCL/Sr组的荧光信号极少，而EP@PCL/Sr处理组的荧光强度显著增强。

2.8. EP@PCL/Sr支架在体内植入刺激血管生成和骨缺损修复

皮下植入实验显示，植入1周后，EP@PCL/Sr支架处理组的组织炎症细胞显著减少，并有显著的新血管形成。而PCL和PCL/Sr支架周围组织观察到明显的炎症细胞簇，无新血管形成。CD31免疫荧光染色显示，植入1周后，EP@PCL/Sr组有大量新血管形成，而PCL和PCL/Sr支架周围组织无或极少新血管形成。植入2周后，EP@PCL/Sr支架周围组织显示最广泛的新血管形成。

大鼠颅骨缺损模型显示，植入12周后，Micro-CT成像和相应热图分析显示，CON和PCL组在骨缺损部位几乎无新骨组织形成，而PCL/Sr和EP@PCL/Sr支架处理组显示不同程度的新骨形成，其中EP@PCL/Sr支架组的骨再生最显著。组织学染色显示，EP@PCL/Sr支架处理组显示最高量的新骨组织，有大量成熟成骨细胞沿骨基质边缘排列促进骨样发育。免疫组化染色显示，EP@PCL/Sr支架处理组周围组织的OCN和COL-I阳性（棕色染色）区域最大且最深。

该研究成功设计并合成了Sr-SF-HA NPs，通过3D打印技术将其纳入PCL支架，并用EGCG和PEI涂层修饰，制备出EP@PCL/Sr支架。该支架表现出优异的抗氧化、免疫调节、血管生成和成骨特性，促进大鼠颅骨缺损修复。研究证实支架具有良好的生物相容性，通过激活ITGA10/PI3K/AKT通路结合优异的血管生成活性促进rBMSCs成骨分化，能有效清除活性氧保护细胞免受氧化应激，通过抑制巨噬细胞向M1型极化和促进向M2型极化表现出强大的免疫调节特性，在体内皮下模型中重塑免疫环境并诱导血管生成，显著增强颅骨缺损大鼠的骨缺损修复。EP@PCL/Sr支架是一种促进血管生成、成骨、抗氧化和免疫调节的多功能生物材料，为骨缺损修复提供了有前景的新策略。