胶原蛋白-纤维蛋白互穿水凝胶的基质影响：探索微血管网络与骨生成的新平衡

本刊推荐：为解决组织工程中体积移植物血管化难题，研究人员开展胶原(Col)-纤维蛋白(Fib)互穿水凝胶调控微血管片段(MVFs)与间充质干细胞(MSCs)共培养体系的研究。发现50:50 Col:Fib配比通过平衡基质降解速率与力学性能，最佳支持血管网络形成与成骨基因表达，为骨组织工程中血管化-成骨耦合提供新型基质材料设计策略。

　　

在组织工程领域，体积移植物的功能性血管化始终是制约临床转化的核心难题。细胞存活严格依赖于150-200μm范围内的毛细血管供氧，而传统工程化组织缺乏内在血管网络，导致移植后核心区域细胞坏死。当前策略包括递送血管生成因子、预血管化支架设计及微流体技术等，但均未能完全模拟生理性血管生成过程。微血管片段(Microvascular Fragments, MVFs)作为一种包含小动脉、小静脉和毛细血管的多细胞团簇，从脂肪组织分离后展现出快速形成血管网络的卓越能力，且天然携带促血管生成因子和干细胞群体，为体外预血管化提供了新思路。

与此同时，胶原(Collagen, Col)与纤维蛋白(Fibrin, Fib)作为天然细胞外基质蛋白，因其生物相容性和促细胞粘附特性被广泛用于组织工程支架。两者形成的互穿聚合物网络(Interpenetrating Polymer Network, IPN)水凝胶表现出独特的力学性能和降解特性，但不同配比对血管生成与骨生成的协同调控机制尚不明确。德克萨斯大学圣安东尼奥分校研究团队在《Biomaterials and Biosystems》发表研究，通过系统分析Col:Fib水凝胶的基质组成、力学特性及其对MVFs与间充质干细胞(MSCs)共培养体系的调控作用，揭示了基质比例在血管化-成骨耦合过程中的关键作用。

研究主要采用五种Col:Fib配比（100:0、75:25、50:50、25:75、0:100）制备物理交联IPN水凝胶。通过单轴拉伸测试、纳米压痕技术及流变学分析表征材料力学性能；采用Masson三色染色量化基质成分变化；通过体外共培养模型，将MVFs与MSCs接种于水凝胶中，在成骨诱导培养基中培养14天，利用免疫荧光染色观察血管网络形成，qRT-PCR技术分析成骨（runx2、bmp2、on、col1a1）与血管生成相关基因（vegfa、hif1a）表达；并通过主成分分析(PCA)整合多维度数据评估变量间相关性。

3.1. 水凝胶材料特性表征

研究发现不同配比水凝胶的宏观弹性模量无显著差异，但纳米压痕测得的局部弹性模量存在显著区别。25C75F组模量显著高于纯纤维蛋白组(100F)，50C50F与75C25F组则与其他组均存在差异，表明混合凝胶呈现协同增强效应。流变学测试显示纯胶原组(100C)储存模量最高，而75C25F与100C组的损耗模量显著高于其他组。Masson三色染色证实混合凝胶并非完全均质，存在明显的相分离现象，支持"海岛模型"理论——次要组分以岛屿形式分散于主要组分网络中。

3.2. 水凝胶时间依赖性变化

在生理pH(7.4)和伤口pH(6.0)环境下进行的降解实验表明，纯纤维蛋白凝胶(100F)在第3-4天完全降解，而胶原含量较高的组别降解速率较慢。非破坏性流变学监测显示50C50F组存储模量最低但高度最稳定，75C25F组则保持最大高度变化，说明各组具有不同的长期稳定性。

3.3. 血管生成过程中的基质变化

MVFs单独培养时，高纤维蛋白组(100F、25C75F)的纤维蛋白含量保持稳定，而50C50F组纤维蛋白随时间逐渐降解。第3天出现全局性模量下降，表明细胞介导的基质重塑活跃。胶原含量在含50%及以上胶原的组别中保持稳定，而在高纤维蛋白组中随培养时间增加，提示细胞分泌新的胶原基质。免疫荧光显示高纤维蛋白组细胞分布更均匀，而高胶原组细胞多集中于凝胶边缘。

3.4. 基质对血管生成的影响

基因表达分析显示vegfa在100C组表达最高，第3天出现表达峰值。hif1a与bmp2同样在第3天表达最高，而on与col1a1在第14天表达显著上调。研究发现第3天是细胞行为转变的关键节点，符合伤口愈合过程中炎症期向增殖期转变的特征，MVFs中存在的巨噬细胞和血管周细胞可能在这一转变中发挥重要作用。

3.5. 基质与基质细胞的相互作用

添加MSCs后，基质的降解和重塑更为显著。25C75F与50C50F组纤维蛋白含量显著降低，而100C组则因细胞质染色呈现高"纤维蛋白"信号。弹性模量变化显示所有组别在第7-14天显著增加，表明细胞分泌的基质蛋白增强了材料力学性能。50C50F组表现出最稳定的基质转化平衡，模量最终恢复到与无细胞凝胶相当水平。

3.6. 基质支持对血管生成的作用

共培养体系中，100C组的vegfa和bmp2表达最高，但血管网络形成却最差，表明高基因表达不一定转化为功能性输出。相反，高纤维蛋白组(100F、25C75F、50C50F)的hif1a表达随时间变化最大，且血管网络形成最好。25C75F和50C50F组在on表达上表现最佳，表明这两组最能支持成骨-血管生成耦合。

3.7. 多变量相关性分析

主成分分析显示，约30.4%的变异由材料组成驱动(PC1轴)，而时间因素沿PC2轴分布。变量贡献图表明胶原含量与纤维蛋白含量呈强负相关；vegfa与bmp2表达正相关并与纤维蛋白含量正相关；凝胶模量与on表达正相关并与胶原含量正相关。有趣的是，hif1a与vegfa表达几乎正交，表明在该体系中VEGFa表达可能主要来自MSCs的旁分泌信号，而非缺氧驱动的Hif1α通路。

该研究通过系统分析不同Col:Fib配比水凝胶的理化特性及其对MVFs-MSCs共培养体系的影响，证明50:50配比最能平衡血管生成与成骨过程。这种平衡体现在基质降解与细胞分泌的协调、血管网络形成与成骨基因表达的同步以及力学性能的稳定性等方面。研究首次揭示了Col:Fib水凝胶中存在的"海岛模型"现象对细胞行为的深远影响，以及第3天作为细胞行为转变关键节点的时相特征。研究结果不仅为骨组织工程中的血管化策略提供了新材料设计思路，也深化了对细胞-基质相互作用在组织再生中复杂调控机制的理解。这种基于基质组成调控的血管化-成骨耦合策略，为开发下一代功能性组织工程 constructs 提供了重要理论基础和实践指南。