靶向PD-1与LAG-3的双特异性抗体格式比较研究：为癌症免疫治疗提供新型双检查点阻断策略

本研究针对PD-1/LAG-3双特异性抗体（BsAbs）格式缺乏系统比较的问题，开展了三种BsAbs格式（YG-003D1/Ab-ScFv、YG-003D2/DVD、YG-003D3/KIH）的全面对比研究。结果表明：YG-003D3（KIH格式）在可制造性、稳定性和药代动力学方面表现最佳，是最具临床转化前景的候选分子；YG-003D1（Ab-ScFv格式）虽具有最强的结合和阻断活性，但存在表达量低和易聚集的问题；YG-003D2（DVD格式）则存在明显的空间位阻。该研究为PD-1/LAG-3双特异性抑制剂的理性设计提供了关键框架，对推动下一代癌症免疫治疗具有重要意义。

　　

在癌症免疫治疗领域，免疫检查点抑制剂（Immune Checkpoint Inhibitors, ICIs）的出现彻底改变了多种癌症的治疗格局。其中，程序性死亡受体-1（Programmed Death-1, PD-1）的抑制剂，如帕博利珠单抗（Pembrolizumab）和纳武利尤单抗（Nivolumab），通过重新激活T细胞攻击肿瘤，在部分患者中取得了持久的疗效。然而，一个显著的临床挑战是，仍有大量患者对PD-1单药阻断无应答或产生获得性耐药。研究发现，这种耐药性往往与另一个重要的免疫检查点——淋巴细胞激活基因-3（Lymphocyte-Activation Gene 3, LAG-3）的代偿性上调有关。LAG-3和PD-1在多种人类肿瘤和小鼠模型的瘤内T细胞上存在共表达现象，例如，在经ICI治疗的肺淋巴上皮瘤样癌（PLELC）样本中，PD-1和LAG-3的共表达比率高达42.1%。这种共表达导致了T细胞衰竭（T Cell Exhaustion），限制了单一靶向治疗的疗效。因此，同时阻断PD-1和LAG-3信号通路，协同增强抗肿瘤免疫力，成为了克服PD-1阻断耐药性的一个有前景的策略。

尽管联合使用抗PD-1和抗LAG-3的两种单克隆抗体（monoclonal Antibodies, mAbs）的临床试验（如RELATIVITY-047试验）已显示出优于PD-1单药的疗效，但两种抗体联合使用的方案存在制造工艺复杂、药代动力学（Pharmacokinetics, PK）特性难以匹配以及潜在毒性增加等问题。双特异性抗体（Bispecific Antibodies, BsAbs）作为一种变革性方法，能将两种特异性整合到一个分子中，同时靶向PD-1和LAG-3，从而简化制造、改善药代动力学，并通过在耗竭T细胞上实现同步阻断来增强治疗协同效应。然而，BsAbs的开发充满挑战，需要在其结构稳定性、功能活性和药代动力学特性之间取得精妙平衡。尽管对PD-1/LAG-3 BsAbs的兴趣日益增长，但不同BsAb格式的系统性比较仍然缺乏，这为优化这些治疗分子的理性设计留下了关键空白。

为了填补这一空白，王杰、石宁、赵品楠等研究人员在《Biomedicine 》上发表了一项深入研究。他们系统地设计、制备并比较了三种不同的BsAb格式：YG-003D1（Ab-ScFv格式）、YG-003D2（DVD-Ig格式）和YG-003D3（Knob-into-Hole, KIH格式），全面评估了它们的结构、功能和药代动力学特性，为优化PD-1/LAG-3双检查点阻断疗法提供了关键的见解和框架。

为开展本研究，作者运用了多项关键技术方法。在抗体设计与制备方面，采用了三种不同的基因工程策略构建了YG-003D1、YG-003D2和YG-003D3。蛋白表达使用ExpiCHO-S?细胞系统，并通过Protein A亲和色谱进行纯化，其中YG-003D3的“Knob”和“Hole”半抗体分别表达纯化后，在特定pH条件下诱导异源二聚化组装。在质量控制和生物物理表征方面，采用了SDS-PAGE、尺寸排阻色谱（SEC-HPLC）以及高通量蛋白质稳定性分析仪（测定Tm和T_agg）等技术。功能评价涵盖了多种体外结合与阻断实验：使用间接ELISA和生物层干涉技术（BLI）评估结合亲和力；采用双抗原夹心ELISA和顺序BLI分析评估同时结合能力与空间位阻；通过竞争ELISA和流式细胞术检测抗体对PD-1/PD-L1和LAG-3/MHC-II相互作用的阻断效能。在免疫学功能分析上，研究使用了人外周血单核细胞（PBMCs）活化实验和混合淋巴细胞反应（MLR）模型来评估BsAbs激活T细胞和促进细胞因子（如IFN-γ和IL-2）分泌的能力。此外，还通过体外细胞交叉链接实验（使用荧光染料标记的293T-PD-1和293T-LAG-3细胞）评估了BsAbs介导细胞聚集的潜力。药代动力学研究则在C57BL/6小鼠模型中进行，通过静脉注射给药并在预设时间点采血，利用抗原特异性ELISA测定血清抗体浓度，计算半衰期和清除率等参数。本研究所用的人PBMCs样本来源符合伦理规范并获得了知情同意。

3.1. BsAbs的制备和质量控制分析

研究人员成功制备了三种BsAbs。YG-003D3（KIH格式）表现出远超其他两种格式的表达效率（Knob和Hole组分的产量分别达到143.4 mg/L和269.16 mg/L），而YG-003D1和YG-003D2的表达量较低。SEC-HPLC分析显示YG-003D2和YG-003D3的单体纯度超过99%，而YG-003D1存在明显的聚集倾向，单体含量仅为70.51%。热稳定性分析表明，YG-003D3具有最高的熔解温度（T_m = 63.8°C）和聚集起始温度（T_agg = 66.1°C），显示出最佳的结构稳定性。

3.2. 蛋白质水平的功能表征

在等效摩尔浓度下，三种BsAbs均表现出与PD-1和LAG-3的强效、剂量依赖性结合，EC₅₀值在0.2至0.6 nM之间。BLI测定的亲和力（K_D）也相近。值得注意的是，所有BsAbs均通过Fc区的N297A突变成功消除了与CD16a的结合，从而去除了抗体依赖性细胞毒性（ADCC）效应，这是免疫检查点抑制剂所期望的特性。在功能阻断方面，YG-003D1显示出最强的阻断活性，能有效抑制PD-1/PD-L1和PD-1/PD-L2的相互作用，其EC₅₀值最低（分别为12.93 nM和17.82 nM），这归因于其Ab-ScFv结构的四价性和结合位点的空间分离减少了位阻。

3.3. BsAbs与PD-1和LAG-3结合的空间位阻评估

通过双抗原夹心ELISA和顺序BLI分析评估了BsAbs同时结合两个靶点的能力。YG-003D1表现出最高的同时结合效率（EC₅₀ = 2.154 nM），其结合位点的空间分离最大限度地减少了空间位阻。YG-003D2（DVD格式）的EC₅₀值最高（14.91 nM），表明其邻近的结合域存在明显的空间约束。YG-003D3作为双价双功能抗体，其同时结合能力介于两者之间，但显著优于YG-003D2，且BLI分析显示其几乎不存在空间位阻。

3.4. BsAbs的细胞水平分析：结合和阻断功效

在细胞水平上，所有BsAbs均能与表达PD-1或LAG-3的293T细胞以及人PBMCs呈剂量依赖性结合。在阻断细胞表面PD-1/PD-L1和LAG-3/MHC-II相互作用方面，YG-003D1再次展现出最强的阻断效能，而YG-003D2对LAG-3/MHC-II的阻断效果最弱，进一步印证了其结构带来的功能局限性。

3.5. BsAbs的交联能力

一个有趣的现象是，所有三种BsAbs均能有效介导表达PD-1的细胞和表达LAG-3的细胞之间的交叉链接，显著促进细胞聚集，在10 nM浓度下诱导的交联比率均超过27%。这表明除了简单的“解刹车”作用外，这些BsAbs还可能通过将免疫细胞拉近而增强细胞间的通讯，从而放大抗肿瘤免疫反应。

3.6. 评估BsAbs的免疫激活效果

在功能上，三种BsAbs均能显著激活PBMCs和MLR模型中的T细胞，导致干扰素-γ（IFN-γ）和白介素-2（IL-2）的分泌增加。特别值得注意的是，YG-003D3在促进IFN-γ分泌方面表现突出，但在高浓度下并未引起IL-2的同等增加，提示其可能优先激活自然杀伤（NK）细胞和CD8⁺ T细胞，这为其在特定肿瘤微环境中的应用提供了线索。

3.7. 药物代谢分析

药代动力学研究是决定候选分子能否走向临床的关键。在小鼠模型中，YG-003D1表现出最慢的血浆清除率，其半衰期（107小时）甚至略长于对照IgG（102小时）。YG-003D3的药代动力学特征与天然IgG几乎完全相同，半衰期为103小时，显示出极佳的体内稳定性。而YG-003D2的清除速度最快，半衰期仅为50小时，表明DVD结构修饰可能会缩短抗体的体内半衰期。YG-003D3兼具良好的功能性和类IgG的药代动力学特性，是其成为理想临床候选分子的关键优势。

研究的讨论部分对上述发现进行了深入的机理阐释和意义升华。不同BsAb格式的功能特性差异根本上源于其结构设计：YG-003D1（Ab-ScFv）凭借其结合域的空间分离实现了高效的双靶点结合和阻断，但牺牲了可制造性（低表达、易聚集）；YG-003D2（DVD）则因结合域邻近而产生空间位阻，影响了其功能效力；YG-003D3（KIH）通过不对称设计巧妙地平衡了可制造性、稳定性和功能性，虽为单价结合，阻断效力略逊于YG-003D1，但其综合优势最为突出。Fc区的N297A突变成功消除了不必要的ADCC效应，确保了治疗的安全性。这些机理见解为未来BsAbs的理性设计提供了明确方向，例如对YG-003D1进行Fc工程或 linker（连接肽）优化以改善其表达和聚集问题；为YG-003D2引入柔性linker以缓解空间位阻；对YG-003D3进行亲和力成熟（Affinity Maturation）或进一步的Fc工程，在保留其优异药代动力学的同时增强其阻断效力。

该研究的结论明确指出，YG-003D3（KIH格式）在可制造性、稳定性和药代动力学方面表现最佳，是进行临床开发的最有前途的候选分子。同时，YG-003D1（Ab-ScFv格式）因其卓越的生物学活性，也值得通过进一步的蛋白质工程进行优化和探索。这项研究不仅为PD-1/LAG-3双特异性抑制剂的优化设计提供了关键的数据支持和理论框架，证明了通过合理的结构设计可以克服BsAb开发中的诸多挑战，而且其研究范式和对不同格式的深刻理解也对更广泛的BsAbs在免疫治疗中的应用具有重要的参考价值，有望推动下一代更有效、更安全的双检查点 blockade 疗法的快速发展。