纸基折纸辅助增强电化学分析技术用于血浆中β-淀粉样肽检测的研究

本研究针对阿尔茨海默病早期诊断中血浆β-淀粉样肽(Aβ(1–42))检测灵敏度不足的难题，开发了一种结合纸基折纸预富集技术的无标记电化学免疫传感器。通过系统优化电极修饰参数和折纸富集方法，实现在缓冲液和未稀释血浆中分别达到2.7 ng/mL和4.7 ng/mL的检测限，并获得最高5倍的信号增强效果。该平台具有优异的选择性和重复性，为开发低成本、便携式阿尔茨海默病早期筛查工具提供了新策略。

　　

在全球老龄化加剧的背景下，阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD）已成为最常见的神经退行性疾病，占全球痴呆病例的60-70%，影响超过5500万人。随着疾病不可逆的进展和缺乏根治方法，早期准确诊断对及时干预至关重要。β-淀粉样肽（Aβ(1–42)）作为AD最早和最明确的病理标志物之一，在大脑中形成细胞外斑块，被公认为早期和准确诊断的核心生物标志物。

然而，当前Aβ检测技术面临重大挑战。脑脊液（CSF）虽然是测量Aβ水平的金标准基质，但其采集具有侵入性，不适合人群水平筛查或纵向监测。现有技术如酶联免疫吸附测定（ELISA）、质谱（MS）和正电子发射断层扫描（PET）虽然具有高灵敏度和特异性，但耗时昂贵，需要中央实验室和熟练人员。PET成像虽然能有效可视化体内淀粉样蛋白沉积，但涉及放射性示踪剂，不适合常规筛查或早期监测。这些局限性凸显了对可及、快速和成本效益高的诊断工具的迫切需求。

血液检测工具因其微创性和可及性而受到临床和研究关注，但检测血浆中的Aβ(1–42)尤其具有挑战性，因为其含量极低。在认知健康个体中，血浆Aβ(1–42)浓度通常为8-30 pg/mL，在AD临床前阶段可能升至30-50 pg/mL，在轻度认知障碍（MCI）和AD中又常降至20 pg/mL以下。因此，只有高灵敏度和高选择性的技术才能满足血浆Aβ检测的分析需求。

电化学生物传感器在弥合这一差距方面显示出强大潜力，具有低成本制造、快速响应时间和微型化兼容性等特点。特别是屏幕印刷电极（SPEs）因其易于生产和集成到便携式格式中的潜力而被广泛探索用于AD生物标志物检测。然而，许多传感器依赖于涉及酶或荧光标记的标记检测策略，这可能使制造复杂化、降低稳定性并阻碍实时或现场应用。

在这项发表于《Biosensors and Bioelectronics: X》的研究中，意大利那不勒斯费德里科二世大学的研究团队开发了一种无标记电化学免疫传感器，用于检测Aβ(1–42)，基于屏幕印刷电极（SPEs）并通过预富集方法增强，旨在缩小灵敏度差距。这种预富集装置基于纸基折纸结构，先前由研究小组开发并验证用于富集各种生物分子，包括miRNAs、dsDNA和小分子，证明了其多功能性、速度快和与低资源诊断格式的兼容性。

研究人员主要采用了屏幕印刷电极制备与修饰、电化学表征技术、纸基折纸预富集技术和选择性评估等方法。屏幕印刷电极在柔性聚酯薄膜上制备，使用银/氯化银墨水打印连接和参比电极，碳墨水打印工作和对抗电极。电化学测量使用便携式恒电位仪进行，包括循环伏安法（CV）和电化学阻抗谱（EIS）。免疫传感器通过多步表面修饰程序制备，从金的电化学沉积开始，然后形成自组装单层（SAMs），随后进行抗体固定化和阻断步骤。纸基折纸预富集装置通过蜡印技术制造，由十层组成，用于被动毛细管驱动的目标物富集。选择性测试针对瘦蛋白、人血浆凝血酶和牛血清白蛋白（BSA）等干扰蛋白进行。所有实验使用来自健康志愿者的血浆样本进行加标验证。

3.1. 免疫传感器的优化

通过循环伏安法（CV）和电化学阻抗谱（EIS）对免疫平台逐步组装进行电化学表征。金电沉积后，由于新鲜沉积的纳米结构金增强了表面导电性，观察到峰值电流增加。随着MPA功能化和随后的生物分子固定化步骤，电流逐渐减少，归因于分子层日益增长的立体阻碍和绝缘性能，阻碍了氧化还原探针向电极表面的扩散。EIS提供了界面电荷转移电阻（Rct）变化的洞察，在每个功能化步骤后，Nyquist半圆的直径增加，与连续组装非导电层一致。为了最大化生物传感器的性能，优化了四个关键参数：金纳米结构化方法、MPA浓度、抗体浓度和Aβ(1–42)目标孵育时间。电极表面纳米结构化通过比较滴铸金纳米粒子（AuNPs）和金电沉积（5mM）两种修饰策略进行评估，电沉积导致显著更高的信号变化（约35%），而AuNPs仅为约12%。MPA浓度在0.05至5 mM范围内优化，0.5 mM MPA获得最高信号变化。抗Aβ(1–42)抗体浓度在0.01至10 μg/mL范围内变化，1 μg/mL获得最高信号变化。Aβ(1–42)目标在免疫传感器上的孵育时间通过测试15、30和60分钟三个时间间隔进行优化，30分钟孵育提供最高信号变化，表明在此时间范围内最佳的抗原-抗体相互作用。

3.2. 分析性能

开发的无标记免疫传感器对Aβ(1–42)检测的分析性能通过在存在1 mM [Fe(CN)₆]^3-/^4-的情况下通过差分脉冲伏安法（DPV）进行评估。增加Aβ(1–42)浓度导致电流信号逐渐减少，归因于氧化还原探针扩散受阻由于电极表面抗体-抗原复合物的形成。得到的校准曲线通过绘制百分比信号变化与Aβ(1–42)浓度在0.005至10 μg/mL范围内的关系构建，产生指数样响应，使用非线性回归模型拟合。在0.002至1 μg/mL之间观察到明确线性范围，描述为线性回归方程：y = 40.4x + 12.2（R² = 0.97），其中y是信号变化（%），x是Aβ(1–42)浓度（μg/mL）。基于此范围，检测限（LOD）和定量限（LOQ）分别计算为2.7 ng/mL和9.0 ng/mL，使用3σb/m和10σb/m标准（其中σb是空白信号的标准偏差，m是回归线的斜率）。免疫传感器表现出优异的重复性，相对标准偏差（RSD%）为6.0%（n = 4），针对0.5 μg/mL的中间浓度。

3.3. 选择性研究

开发任何生物传感器的关键问题是选择对目标具有高特异性的生物受体。在这方面，评估了捕获抗体对生物体液中常见非目标蛋白的潜在干扰和交叉反应性，以评估所提出免疫传感器的选择性。选择性测试通过将传感器应用于单独的非目标蛋白和包含干扰蛋白和目标Aβ(1–42)的混合物进行。选择的干扰物包括瘦蛋白（0.1 μg/mL）、人血浆凝血酶（0.1 μg/mL）和牛血清白蛋白（BSA）（1 mg/mL）。这些蛋白质基于其在血浆中的丰度或相关性及其分子大小选择，其大小与Aβ(1–42)相当或更大。免疫传感器在单独暴露于这些蛋白质时表现出可忽略的信号变化（高达4%），证实了抗Aβ(1–42)抗体的高特异性。此外，当每个干扰物与0.1 μg/mL的Aβ(1–42)一起测试时，传感器响应与仅Aβ(1–42)对照一致，未观察到显著偏差。学生t检验 performed比较不同选择性条件下的传感器响应。虽然瘦蛋白（p = 0.027）和BSA（p = 0.009）单独显示与空白有统计学显著偏差，所有干扰物+Aβ混合物与仅Aβ条件相比无显著差异（p > 0.05）。这表明非特异性血浆蛋白的存在不阻碍生物传感器准确识别和响应其目标的能力。

3.4. 在加标健康血浆样本中的应用

为了评估开发的免疫传感器在临床相关基质中的实际适用性，其性能使用未稀释人血浆样本加标已知浓度的Aβ(1–42)进行评估。测量在与缓冲液中使用的相同条件下进行，使用DPV在存在1 mM [Fe(CN)₆]^3-/^4-的情况下进行。在血浆中获得的校准曲线遵循与缓冲液中观察到的相似的指数样趋势。在0至0.1 μg/mL的浓度范围内保留线性响应，描述为线性回归方程：y = 293.6x + 2.0（R² = 0.98），实现LOD为4.7 ng/mL和LOQ为15.7 ng/mL。有趣的是，与缓冲液中观察到的相比，未稀释血浆中的线性范围更窄。这种减少可能归因于血浆复杂组成产生的基质效应，如蛋白质、脂质和其他干扰物质。这些组分可能部分污染电极表面或竞争表面结合位点，可能减少固定化抗体的可及性，并导致更早的信号饱和。相应的DPV曲线显示电流信号随着Aβ(1–42)浓度增加而一致减少，证实传感器在复杂血浆基质中保持响应，无需稀释或预处理。

3.5. 使用纸基折纸装置的预富集策略

虽然开发的无标记免疫传感器表现出良好的灵敏度，在缓冲液和血浆中的检测限分别为2.7 ng/mL和4.7 ng/mL，但这些值仍然高于早期阿尔茨海默病中循环Aβ(1–42)通常报告的亚ng/mL浓度。为了克服这一限制并增强平台的检测能力，研究人员采用了纸基折纸预富集装置，先前由小组开发用于核酸富集，无需外部仪器。这种方法利用由商业滤纸制成的10层折叠装置，实现目标物的被动毛细管驱动富集 within 1分钟。该程序装置配置在实验部分详细描述。折纸装置应用于低浓度（0.005、0.01和0.05 μg/mL）Aβ(1–42)在缓冲液和未稀释血浆中的预富集。在缓冲液中，预富集后信号变化增加，折叠变化值为4x至5x，对应所有测试浓度的信号增加316–394%。学生t检验证实所有浓度的增加高度显著（p = 0.0036至0.000006）。这证实了纸基富集系统在改善目标分析物电流信号方面的有效性。在血浆中，效果仍然显著但有所减弱。在两个较低浓度（0.005和0.01 μg/mL）获得4x信号增强，而在0.05 μg/mL仅观察到2x增加。所有改进均统计显著（p = 0.032至0.0088），证实预富集策略即使在复杂生物基质中仍然有效。减少的放大可能归因于血浆中信号饱和的较早发生，如在非预富集校准曲线中观察到的，其中平台区域在较低浓度达到 compared to缓冲液。这种行为可能反映了基质相关效应，如大量血浆蛋白的存在，可能导致生物污染、竞争表面相互作用或限制抗原向固定化抗体的扩散。尽管在较高浓度存在此限制，折纸装置在较低临床相关水平显著增强检测灵敏度，证实其在实际应用中的实用性。

研究结论表明，开发了一种基于屏幕印刷电极的无标记电化学免疫传感器，用于敏感检测β-淀粉样蛋白（Aβ(1–42)），利用纸基折纸装置改善最终设备的分析性能。免疫平台在表面修饰、抗体负载和测定条件方面进行了彻底优化，以实现目标蛋白的可重复和选择性识别。传感器表现出良好的分析性能，在缓冲液和未稀释血浆中的检测限分别为2.7 ng/mL和4.7 ng/mL，并对常见血浆蛋白（如瘦蛋白、凝血酶和BSA）具有高选择性。考虑到血浆中Aβ(1–42)水平在早期阿尔茨海默病中可能低于1 ng/mL，实施了纸基折纸预富集策略以增强检测灵敏度。这种方法实现了Aβ(1–42)的快速、无设备富集，并导致灵敏度增强高达5倍，证明该程序特别适用于检测所选目标的低浓度。

总体而言，所提出的免疫传感器与折纸预富集步骤结合，代表了一种有前途且可扩展的工具，用于点-of-care筛查和阿尔茨海默病的纵向监测。其简单性、无标记设计和与低成本材料的兼容性使其适合未来集成到针对神经退行性疾病的便携式诊断平台中。这项研究的意义在于它提供了一种创新方法，通过结合纸基折纸预富集技术，显著增强了无标记电化学免疫传感器的检测灵敏度，而无需复杂的标记程序或昂贵设备。这种策略特别适用于资源有限的环境，为开发 affordable和可及的阿尔茨海默病早期诊断工具奠定了基础。此外，该平台的多功能性表明它可以适应其他生物标志物的检测，进一步扩展其在神经退行性疾病和其他医疗条件下的应用潜力。