SARS-CoV-2来源的RNA复制子作为安全有效的疫苗：一种新型鼻内接种策略可诱导 sterilizing immunity 并提供广谱保护

本刊推荐：本研究通过基因工程构建了源自SARS-CoV-2的RNA复制子（RRs）疫苗平台，其通过删除六个基因（3a, 3c, E, 6, 7a, 7b）实现复制能力保留但传播缺陷。该RR疫苗通过鼻内接种可诱导强大的呼吸道黏膜免疫，产生针对 Spike (S) 蛋白、受体结合域（RBD）、N和M蛋白的IgG、IgM和IgA抗体，并激发细胞免疫应答（CD4+、CD8+ T细胞及长期记忆T细胞）。实验证明其可提供 sterilizing immunity，有效抑制病毒传播，且安全性高、稳定性好，为新一代COVID-19疫苗开发提供了重要策略。

　　

设计并生产基于SARS-CoV-2缺陷型RNA复制子的疫苗

实验室此前曾开发了基于MERS-CoV的RNA复制子（RR），通过删除五个基因[3,4a,4b,5,E]实现了复制能力保留但传播缺陷的特性，并通过反式互补E蛋白表达质粒包装成病毒样颗粒（VLPs）。针对SARS-CoV-2的RR rescue系统需进行显著修改。通过细菌人工染色体构建了一系列SARS-CoV-2缺失突变体，分别删除以下基因组合：[3a,3c]、[E]、[3a,3c,E]、[3a,3c,E,6,8]、[3a,3c,E,6,7a,7b]、[3a,3c,E,7a,7b,8]和[3a,3c,E,6,7a,7b,8]。删除蛋白3a、3c和E对于获得传播缺陷型RR至关重要。通过质粒表达3a和E蛋白进行反式互补，成功rescue了上述所有SARS-CoV-2 RRs，除了缺失七个基因的突变体。在rescue过程中获得最高滴度（1.9 × 10⁵ FFU/mL）的RR疫苗候选株是SARS-CoV-2-?[3a,3c,E,6,7a,7b]-RR（缩写为RR-?[3a,3c,E,6,7a,7b]-SWU）。通过Western blot分析证实了3a和E蛋白的反式表达。通过反式互补3a和E蛋白rescue的工程化复制子，在细胞培养中传代六次后滴度趋于稳定，约为10⁵ FFU/mL。进一步浓缩处理使RR滴度提高约100倍，达到高于10⁷ FFU/mL，与全长病毒相似，适用于体内评估。这些数据支持选择RR-?[3a,3c,E,6,7a,7b]-SWU用于SARS-CoV-2疫苗的进一步开发。

RR-?[3a,3c,E,6,7a,7b]-SWU VLPs的电子显微镜分析

在缺乏反式提供的3a和E蛋白的情况下，通过电子显微镜研究了SARS-CoV-2病毒和RR-?[3a,3c,E,6,7a,7b]-SWU的形态发生。 mock感染的细胞中未发现病毒颗粒。在病毒感染细胞的细胞质内外均检测到病毒颗粒的存在，而在RR-?[3a,3c,E,6,7a,7b]-SWU感染的细胞中，病毒颗粒仅存在于细胞质内。这些数据表明，在缺乏3a和E蛋白反式互补的情况下，RR构建产生的VLPs被保留在细胞内，从而形成高度安全的传播缺陷型RR。

细胞外病毒或VLPs的数量与野生型病毒或RR-?[3a,3c,E,6,7a,7b]-SWU的感染滴度直接成正比，通过免疫荧光定量分别为9.5 × 10⁸ FFU/mL和0 FFU/mL。全长病毒形成的病毒结构和RR-?[3a,3c,E,6,7a,7b]-SWU形成的VLPs在形态上相似，表明两者应引发相似的免疫应答。

感染后不同时间RR-?[3a,3c,E,6,7a,7b]-SWU的RNA和蛋白表达

在细胞培养中分析了RR-?[3a,3c,E,6,7a,7b]-SWU的病毒RNA合成，直至感染后96小时。基因组RNA（gRNA）和亚基因组RNA（sgmRNA）的积累至少在整个期间保持高水平。该疫苗相对于现有疫苗的一个优势是表达多种病毒抗原，可引发更广泛的免疫应答。通过Western blot分析证实了至少三种病毒蛋白—— Spike（S）、膜（M）和核衣壳（N）——在感染后4天内的合成。

通过RT-qPCR定量了感染SARS-CoV-2病毒或RR-?[3a,3c,E,6,7a,7b]-SWU复制子的小鼠鼻腔和肺中病毒gRNA和sgmRNA-N的合成。在肺中gRNA和sgmRNA的积累高于鼻甲。在感染后1天在鼻甲中检测到来自RR的sgmRNA表达，在肺中在所有时间点均检测到，表明RR的表达持续至少6天。

通过组织病理学、促炎细胞因子诱导和传播缺失评估SARS-CoV-2疫苗安全性

肺组织病理学病变评分显示，在感染后2天，实验组之间无显著差异。然而，在感染后4天和6天，与mock感染的小鼠相比，SARS-CoV-2感染的小鼠肺病变评分显著增加。与感染全长病毒相比，RR感染的小鼠病变减轻，活化细胞浸润减少。感染后2天肺样本中N蛋白的免疫组化（IHC）检测显示，RR-?[3a,3c,E,6,7a,7b]-SWU转染的小鼠中存在标记的肺炎细胞，而全长病毒感染细胞丰度高。这与mock感染的小鼠形成对比，后者病毒抗原缺失。

为检查RR疫苗接种引发的炎症反应，在免疫后1天评估了鼻甲和肺中细胞因子mRNA的积累。评估了干扰素（IFNs）、IFN-β和IFN-λ、两个IFN刺激基因（ISGs）（ISG15和MX1）以及四种促炎细胞因子（TNF、CXCL10、CCL2和IL6）的表达，这些因子在SARS-CoV-2感染后诱导。已描述这些因子的增加与疾病严重程度增加相关，无论是在小鼠还是患者中。 mock感染的小鼠用作阴性对照。 RR在鼻甲中诱导的IFN和促炎反应较低，比野生型病毒引发的反应低10至100倍。此外，接种RR的小鼠肺中引发的IFN或促炎反应非常低。这些结果与组织病理学观察相关，并证实了与野生型病毒感染相比，鼻内免疫RR的负面效应减少。免疫后10天内免疫小鼠体重无减轻，进一步支持了疫苗候选株的安全性。

为加强RR的安全性，尝试从小鼠鼻甲或肺在感染后2、4和6天回收RR-Δ[3a,3c,E,6,7a,7b]-SWU。未rescue到RR，证实了传播缺陷型RR的安全性。相反，全长SARS-CoV-2在小鼠鼻甲和肺中生长至高滴度。这些数据证实了RR在体内传播的缺失。

通过免疫RR-?[3a,3c,E,6,7a,7b]-SWU保护 against SARS-CoV-2-WU感染

在转基因K18-hACE2小鼠中评估了RR-?[3a,3c,E,6,7a,7b]-SWU诱导的保护作用。三组各十只小鼠进行鼻内免疫。第一组和第二组分别免疫一次（prime）或两次（prime and boost），剂量为10⁵ FFU/只，第三组mock免疫。在首次免疫后3周或第二次免疫后2周，用致死剂量的SARS-CoV-2（10⁵ PFU/只）攻击小鼠。攻击后14天内监测体重和小鼠存活率。免疫两次RR的小鼠在攻击后任何时间均未减轻体重。相反，单次免疫后，小鼠最初体重减轻，但在感染后6天开始恢复。未接种疫苗的小鼠体重迅速减轻，攻击后第7天全部死亡或必须处死。所有接种两次疫苗的小鼠存活，而仅接种一次的小鼠仅50%存活。还测试了不同RR剂量的免疫（从10⁴至5 × 10⁵ FFU/只）。数据表明，两次剂量10⁴ FFU/只足以实现完全保护。总之，这些数据表明，prime-boost免疫策略与RR-?[3a,3c,E,6,7a,7b]-SWU可提供针对致死性SARS-CoV-2攻击的完全保护。

在未免疫小鼠的鼻甲和肺中检测到SARS-CoV-2 gRNA和sgmRNA-N。相反，在免疫RR-?[3a,3c,E,6,7a,7b]-SWU的小鼠组织中病毒RNA水平显著较低，且在攻击后4天和6天在鼻甲和肺中均未检测到感染性病毒，表明RR-?[3a,3c,E,6,7a,7b]-SWU提供了 sterilizing immunity。

免疫和未免疫小鼠感染SARS-CoV-2诱导的组织病理学病变

在攻击后第2、4和6天，研究了未免疫与RR-?[3a,3c,E,6,7a,7b]-SWU prime and boost免疫小鼠肺中的组织病理学病变。免疫两次RR-?[3a,3c,E,6,7a,7b]-SWU的小鼠肺样本仅显示局灶性分布的轻度炎症性肺病变，如肺泡间隔增厚，以及偶尔的血管周围淋巴细胞浸润，血管变化较少。相反，从感染后2天起，从未免疫小鼠收集的肺样本显示更严重的炎症损伤。这些包括中度至重度肺泡间隔增厚、血管周围淋巴细胞浸润和肺泡单核细胞浸润。以肺泡出血和肺泡水肿为特征的血管变化从感染后4天起特别严重。在感染后第6天，未免疫小鼠出现广泛水肿，而免疫两次的小鼠明显无水肿，仅观察到轻微的淋巴细胞浸润。为表示病毒的存在，进行了攻击后2天N蛋白的IHC检测。在接种两次疫苗的小鼠中明显缺乏病毒N蛋白，表明针对SARS-CoV-2感染的完全保护。

免疫选定RR后的体液免疫应答

在K18-hACE2小鼠中评估了RR-?[3a,3c,E,6,7a,7b]-SWU诱导的体液免疫原性。两组小鼠分别在第0天仅免疫一次（prime），或在第0天和第21天免疫两次（prime and boost）。在首次免疫后21天（prime）或第二次免疫后14天（prime and boost）采集小鼠血液。平行设置mock免疫的对照组。收集免疫和对照小鼠的血清，通过酶联免疫吸附测定（ELISA）分析针对蛋白S、受体结合域（RBD）、M和N的特异性IgG和IgM抗体水平。免疫一次的小鼠显示针对S和N蛋白的显著IgG反应，当给予两次RR时抗体水平显著增加。针对M蛋白的反应在一次或两次免疫后均较弱。两次施用RR后，针对S蛋白的IgM反应显著。在mock免疫的小鼠中未检测到SARS-CoV-2特异性抗体，也未检测到针对用作阴性对照的肌动蛋白的抗体。

单次剂量RR-?[3a,3c,E,6,7a,7b]-SWU疫苗接种诱导的抗体可中和SARS-CoV-2 Wuhan-like和关注变种如Delta。然而，未检测到针对较新XBB.1.5变种的中和作用。免疫两次RR的小鼠血清中和活性显著高于单次免疫后观察到的活性。

疫苗接种与选定RR-?[3a,3c,E,6,7a,7b]-SWU复制子的细胞免疫应答

T细胞应答对于诱导适应性免疫至关重要。为评估这些应答，小鼠免疫两次（prime and boost）。通过流式细胞术评估了小鼠脾脏中S和N特异性T细胞的存在，其特征是促炎IL2和IFN-γ表达的诱导。在免疫两次RR的小鼠脾脏中检测到N特异性CD4⁺和CD8⁺ T细胞的显著增加，CD4⁺ T细胞群体中分别有2%和7%对IL2和IFNγ呈阳性。类似地，N肽在脾脏CD8⁺ T细胞群体中诱导最高刺激，分别有3%和5%对IL2和IFN-γ呈阳性。在脾脏中也检测到S特异性CD8⁺ T细胞，但水平低于N特异性T细胞。

疫苗接种后建立T记忆细胞库对于持续保护 against 未来感染至关重要。在两次接种RR-?[3a,3c,E,6,7a,7b]-SWU后评估了脾脏中的几个T记忆细胞亚群。未免疫小鼠显示显性T中央记忆（Tcm, CD127⁺ CD62L⁺）表型，其特征是CD127和CD62L的高表达水平。 Tcm群体在CD4⁺和CD8⁺细胞中均 prevalent，分别约占全部细胞的40%和50%。然而，两次剂量RR-Δ[3a,3c,E,6,7a,7b]-SWU疫苗接种将Tcm表型转向T效应记忆（Tem, CD127⁺ CD62L^?）表型，其特征是CD62L低表达和CD127高表达。在此意义上，在接种疫苗的小鼠中，约35%的CD4⁺群体Tem成为显性T记忆细胞表型，30%的CD8⁺群体对应于Tem细胞。总之，我们的结果表明RR-?[3a,3c,E,6,7a,7b]-SWU触发了至少针对S和N病毒蛋白的多功能CD4⁺和CD8⁺ T细胞免疫。此外，RR-Δ[3a,3c,E,6,7a,7b]-SWU诱导了T效应记忆细胞表型。

细胞共感染RR疫苗候选株与全长感染性SARS-CoV-2的抑制

研究了细胞与野生型SARS-CoV-2-XBB1.5病毒和RR-Δ[3a,3c,E,6,7a,7b]-SWU疫苗候选株共感染的潜在后果，该候选株源自Wuhan-Hu-1病毒。在组织培养中，用源自RR的VLPs和SARS-CoV-2-XBB1.5共感染VeroE6-TMPRSS2细胞，并每48小时进行培养上清液的盲传。全长病毒或单独RR用作对照，并分别在VeroE6-TMPRSS2细胞或反式互补的VeroE6-TMPRSS2细胞中传代四次。通过半定量RT-PCR鉴定RR或全长病毒的区别序列域以确定它们的相对丰度。在前两次传代后，RR和全长病毒均存在，但在第三次传代期间，全长病毒特异性条带几乎完全消失，尽管仍可检测到弱条带，表明全长病毒在传代期间以低量存在。在缺乏RR的情况下，全长病毒持续大量存在。此外，病毒滴度在缺乏RR的情况下保持恒定。相反，在存在RR的情况下观察到病毒滴度降低约20倍。总之，这些数据表明RR复制子作为缺陷干扰（DI） RR发挥作用，尽管抑制也可能由全长病毒产生的DIs引起。总体而言，这是一个积极的结果，因为在最近接种疫苗的人感染循环病毒的情况下，在强烈的免疫反应产生之前，RR可以通过干扰和阻断外来病毒的感染程度作为保护性元件。

源自Wuhan病毒的RRs疫苗表达SARS-CoV-2 Wuhan或XBB.1.5变种的S蛋白

SARS-CoV-2的持续循环导致病毒快速进化，产生具有增加传播和免疫逃避特征的SARS-CoV-2变种。在此情况下，SARS-CoV-2疫苗应更新以提供针对当前循环Omicron毒株的免疫力。为证明我们的RR-based疫苗候选株可以在需要时更新，作为原理证明设计了RR-?[3a,3c,E,6,7a,7b]-SXBB.1.5疫苗候选株。RR-?[3a,3c,E,6,7a,7b]-SXBB.1.5复制子源自RR-?[3a,3c,E,6,7a,7b]-SWU，通过用XBB.1.5 S基因替换Wuhan-Hu-1 S基因。两种RRs均稳定，在VeroE6-TMPRSS2细胞中生长至相似滴度，浓缩前约为10⁵ FFU/mL，超速离心浓缩后约为10⁷ FFU/mL。

在转基因K18-hACE2小鼠中评估了RR-?[3a,3c,E,6,7a,7b]-SWU和RR-?[3a,3c,E,6,7a,7b]-SXBB.1.5复制子诱导的保护作用。小鼠鼻内免疫两次剂量10⁵ FFU/只。免疫小鼠分别用10⁵ PFU/只的SARS-CoV-2 Wuhan、Delta或XBB.1.5病毒攻击，以确定针对每种病毒毒株的保护水平。所有未接种疫苗的小鼠在攻击所有SARS-CoV-2变种后死亡。免疫RR-?[3a,3c,E,6,7a,7b]-SWU的小鼠在感染Wuhan或Delta病毒时保持100%体重，全部存活，但在攻击XBB.1.5病毒后体重减轻，50%死亡。相反，接种RR-?[3a,3c,E,6,7a,7b]-SXBB.1.5疫苗的小鼠在攻击Wuhan或Delta病毒时体重迅速减轻，无一存活，而攻击XBB.1.5病毒的小鼠体重未减轻，全部存活。

RR-?[3a,3c,E,6,7a,7b]-SWU和RR-?[3a,3c,E,6,7a,7b]-SXBB.1.5复制子提供的保护得到了通过ELISA测试确定的抗体高水平诱导的支持，并且也由两种RRs引发的血清抗体的中和活性支持。RR-?[3a,3c,E,6,7a,7b]-SWU复制子诱导针对Wuhan和Delta病毒的中和抗体，但不针对XBB.1.5病毒。相反，RR-?[3a,3c,E,6,7a,7b]-SXBB.1.5复制子诱导针对同源病毒的中和抗体，但不针对Wuhan和Delta病毒。总之，这些结果表明RR疫苗候选株可以通过改变掺入RR的S蛋白来源轻松更新。

一个相关问题是RR复制子是否诱导黏膜免疫，通过IgA同种型抗体测量。小鼠免疫两次剂量RR-?[3a,3c,E,6,7a,7b]-SWU复制子，在加强后6天和12天收集血清和支气管肺泡灌洗液（BAL）样本：在免疫小鼠血清中检测到低水平IgA，而BAL中IgA抗体水平较高。此外，BAL样本有效中和SARS-CoV-2变种。免疫RR-?[3a,3c,E,6,7a,7b]-SXBB.1.5导致产生减少但显著水平的IgAs。

不同温度下VLPs储存的稳定性

浓缩VLPs和病毒的稳定性在浓缩形式中比稀释形式更高，如在不同温度下观察到的，这是由于增加的颗粒-颗粒相互作用。此外，特定VLP稳定性还取决于其他因素，如VLP类型或疫苗配方（即缓冲液、佐剂的存在等）。在-20和-80°C下，初始滴度为5 × 10⁴ FFU/ml的RR储备液稳定性在指示温度下储存3个月后得到证明，通过分析不同时间段后细胞培养中病毒灶的形成显示。还通过将RR储存在4°C或室温下评估了RR复制子的稳定性。3个月后，RR滴度降低约100倍或完全灭活。

讨论

通过细菌人工染色体基因工程构建了一系列源自SARS-CoV-2的RRs。从中选择了缺失六个基因的RR-Δ[3a,3c,E,6,7a,7b]-SWU，提供最高滴度。该RR通过反式互补3a和E蛋白rescue为VLP。通过鼻内途径施用该RR显示它是复制能力保留和传播缺陷的。 RR表达几种病毒抗原（至少S、M和N蛋白），增加了其保护能力。设计了两种优化的RR疫苗，每种表达来自两种SARS-CoV-2变种（Wuhan和XBB.1.5）之一的S蛋白，并在Wuhan、Delta或XBB.1.5毒株中提供针对全长病毒的完全保护。

RR Rescue策略

我们的数据表明，产生的源自SARS-CoV-2的RRs通过删除至少三种病毒蛋白（3a、3c和E）是传播缺陷的。一个具有高度实践相关性的进展是证明这些复制子可以通过使用简单表达系统pcDNA3.1提供3a和E蛋白反式有效rescue形成VLPs，这些VLPs对于一个周期是感染性的，该系统包括一个减少的巨细胞病毒启动子，被接受用于其整合在 designed for human use的疫苗中。使用复杂诱导表达系统进行互补，在我们的实验室中成功用于rescue源自MERS-CoV的RR，未能实现SARS-CoV-2衍生RRs的有效rescue。可能这是因为MERS-CoV（Merbecovirus）和SARS-CoV-2（Sarbecovirus）属于冠状病毒科内的不同属，尽管它们具有相似的遗传结构，但它们的RNA序列显著不同（约50%），取决于特定基因。

安全策略

选择作为疫苗候选株的RR-Δ[3a,3c,E,6,7a,7b]-SWU产生自扩增RNAs，并且在细胞培养和小鼠中都是传播缺陷的，这是其安全性的基本特征。不同的实验室描述了工程化SARS-CoV-2衍生疫苗的替代程序。这些疫苗基于工程化减毒病毒，而不是构建传播缺陷型RRs，因此仍然具有传播和进化的潜力。本出版物中描述的RR的优势在于其缺乏传播性。

传播缺陷基于删除病毒蛋白3a和E，因为仅反式表达这两种蛋白允许RR VLPs传播。此外，还删除了另一组附属基因，这些基因是毒力因子，例如基因：3c、6、7a和7b，以加强所选疫苗候选株的安全性。我们已经表明，缺乏E基因的SARS-CoV-2病毒具有较低的病毒滴度，这种变异毒株有助于开发减毒疫苗。删除E蛋白影响细胞内运输。 E蛋白是一种位于病毒包膜中的完整膜蛋白，其单体可以寡聚化形成具有离子通道（viroporin）活性的五聚体，如我们实验室所示。蛋白3a也具有离子通道活性，删除蛋白3a可减弱SARS-CoV，如我们实验室所示，其他作者也显示了SARS-CoV-2的情况。

免疫病理学是由高毒力冠状病毒如SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2引起的感染中最决定性的因素之一。这种免疫病理学由加剧的促炎反应和无效的干扰素反应介导。在产生我们的RR疫苗中删除的附属蛋白参与宿主先天免疫反应的失调，有助于增加RR安全性。蛋白3c由与ORF 3a重叠的ORF编码，它通过+1帧的泄漏扫描表达，水平与蛋白3a大致相同。蛋白3c位于线粒体，是通过限制IFN-β产生的先天免疫调节剂。 SARS-CoV-2蛋白3c和其他附属基因的联合删除显著降低了K18-hACE2转基因小鼠的死亡率，表明其中存在毒力因子。据报道，单独删除ORFs 3a和6显著减弱了SARS-CoV-2感染在小鼠模型中的效果。 ORF 7a与通过抑制骨髓基质抗原2增加病毒产生相关，并与针对干扰素反应的拮抗功能相关，这可能有助于病理学。删除蛋白7a对病毒毒力有适度降低。 ORF 7b也被描述为干扰素反应的潜在抑制剂，尽管在感染背景下需要更多研究，它可能 facilitating SARS-CoV-2发病机制。

缺乏相关免疫病理学，通过缺乏组织病理学病变和RR施用后在鼻甲和肺中诱导的轻微炎症反应加强了RR疫苗候选株的安全性。此外，在RR疫苗施用后未观察到小鼠行为、嗜睡或毛发蓬乱外观的显著变化。

原则上，开发的RR疫苗的施用可能 followed by 循环全长病毒的感染，在保护性免疫反应发展之前。有趣的是，当我们用RR-?[3a,3c,E,6,7a,7b]-SWU和异源病毒（SARS-CoV-2-SXBB.1.5）共感染时，观察到我们的RR疫苗几乎完全抑制了病毒的生长，很可能是因为RR复制子作为DI发挥作用，尽管抑制也可能由全长病毒产生的替代DIs引起。这些结果将支持RR作为DI发挥作用的假设。这一事件增加了RR疫苗在保护性免疫已经引发之前的潜在安全性。

免疫原性和保护效力

免疫RR-?[3a,3c,E,6,7a,7b]-SWU复制子提供了完全保护并引发了中和抗体、黏膜免疫和不同类型的细胞免疫反应[记忆CD4⁺和CD8⁺ T细胞]。免疫RR-?[3a,3c,E,6,7a,7b]-SXBB.1.5复制子表达SARS-CoV-2 XBB.1.5变种的S蛋白，也引发了针对同源攻击的完全保护并引发了中和抗体。有趣的是，免疫RR-?[3a,3c,E,6,7a,7b]-SWU复制子几乎完全 prevented 攻击感染性病毒在鼻甲和肺中的检测，表明复制子提供了 sterilizing immunity。

成就与局限性

Omicron SARS-CoV-2毒株的快速进化通常需要每年更新疫苗以有效提供针对新循环SARS-CoV-2毒株的保护。事实上，已表明XBB.1.5毒株在2023年占主导地位，而在2024年JN.1毒株成为主导，因为94%的循环毒株显示新血清型，包括S蛋白内超过30个氨基酸替换。幸运的是，更新RRs的设计可以在短短2到3个月内实现。这很重要，因为我们的疫苗对三种连续SARS-CoV-2毒株（Wuhan、Delta和XBB.1.5）的功效研究显示，针对较新毒株XBB.1.5的保护逐渐减少，同时RR-SXBB.1.5针对同源病毒提供完全保护。

为了扩大RR VLPs生产，正在考虑 several improvements。已经产生了表达SARS-CoV-2蛋白3a和E的转化包装细胞系。在此阶段，这些细胞系并非