肛门涂片中宿主细胞DNA甲基化标志物ZNF582和ASCL1水平预测既往高级别病变患者进展为肛门癌的风险

为解决肛门癌筛查中高危人群分层和高效分诊的临床需求，研究人员开展了一项多中心队列研究，通过检测肛门涂片中ZNF582和ASCL1基因甲基化水平，发现其与细胞学异常、hrHPV感染及p16/Ki67双染阳性显著相关，且在纵向研究中证实其高水平可独立预测肛门癌进展（AUC>0.8），为优化肛门癌筛查策略提供了新型分子标志物。

　　

肛门癌虽然在全球范围内属于相对罕见的恶性肿瘤，但其发病率近年来呈现持续上升趋势，特别是在高风险人群中——包括HIV感染者、男男性行为者（MSM）、有HPV相关高级别生殖道病变或癌症病史的女性以及实体器官移植后免疫抑制患者。绝大多数肛门癌为鳞状细胞癌，其中90%以上与高危型人乳头瘤病毒（hrHPV）感染密切相关，尤其以HPV16型最为常见。与宫颈癌类似，肛门癌的发生也经过癌前病变阶段，即肛门上皮内瘤变（AIN），按严重程度分为1至3级。

尽管肛门癌的防治可借鉴宫颈癌的成功经验，但目前全球尚未就肛门癌的筛查策略达成共识。2022年发表的ANCHOR研究证实，对高级别肛门上皮内瘤变（HGAIN）进行治疗可有效降低肛门癌的发病率，这推动了筛查指南的更新。2024年，法国和国际肛门 neoplasia 学会（IANS）分别发布了基于细胞学和/或hrHPV检测的筛查建议。然而，这些方案的落地实施面临巨大挑战，主要瓶颈在于高分辨率肛门镜检查（HRA）资源严重不足。HRA不仅设备昂贵，而且需要医师经过长期专业培训，其操作和诊断具有较高难度。此外，并非所有检出的高级别病变都会进展为癌症，过度诊断和治疗同样会给患者带来不必要的负担和伤害。因此，开发能够精准识别高风险病变、优化分诊流程的分子标志物，已成为肛门癌筛查领域迫在眉睫的需求。

在宫颈癌筛查中，宿主细胞DNA甲基化标志物已展现出卓越的应用前景，其检测性能优异，并对宫颈癌的发生具有重要的预测价值。然而，由于组织特异性，这些标志物并不能直接平移用于肛门癌的筛查。例如，在宫颈癌中表现良好的标志物如CADM1、MAL等，在肛门病变中的预测价值有限，甚至因人群HIV感染状态而异。近年来，研究者发现ZNF582和ASCL1等基因的甲基化水平在肛门高级别病变和癌组织的活检标本中显著升高，但其在无创性肛门涂片上的可行性及预测价值尚需在真实世界的前瞻性队列中予以验证。

为此，研究人员在法国多中心AIN3队列的基础上开展了一项辅助性研究，旨在评估肛门涂片中ZNF582和ASCL1甲基化水平与病变严重程度的相关性，并首次在纵向随访中探究其对肛门癌发生的预测能力。该研究成果正式发表在《eBioMedicine》上，为肛门癌的分子分诊提供了关键证据。

本研究主要采用了以下关键技术方法：研究依托于法国国家多中心前瞻性AIN3队列，纳入有AIN3病史的患者，收集其基线肛门涂片样本。对样本进行细胞学诊断（采用Bethesda系统分类）、hrHPV检测及分型（使用Abbott Alinity系统）、p16/Ki67双染检测（CINtec PLUS assay）。宿主DNA经提取和亚硫酸盐转化后，采用多重定量甲基化特异性PCR（qMSP）对ZNF582和ASCL1进行甲基化水平定量，以ACTB作为内参基因，并通过ΔΔCt法计算相对甲基化水平。统计学分析包括Wilcoxon秩和检验、Cox比例风险模型、时间依赖性ROC曲线（C/D AUC）分析等，以评估标志物与临床终点的关联及预测效能。

患者特征与临床演变

研究共分析了514例具有足够宿主细胞DNA的基线肛门涂片。患者平均年龄50.8岁，40%为女性，41%为HIV感染者（其中91%为男性）。中位随访时间48个月，期间22名患者（4%）进展为肛门癌。从取样到诊断癌的中位时间为25.8个月。

肛门涂片的细胞病毒学特征

在基线涂片中，14%为HSIL，81%检出hrHPV，52%检出HPV16，53%的p16/Ki67双染检测为阳性。

甲基化水平与涂片上其他变量的横断面比较

研究发现，ZNF582和ASCL1的甲基化水平与细胞学异常严重程度显著正相关。HSIL涂片中的甲基化水平显著高于非HSIL涂片。同时，甲基化水平在p16/Ki67双染阳性、hrHPV阳性（尤其是HPV16阳性）的样本中也显著更高。这些关联在HIV阳性与阴性人群中均基本一致。两种标志物区分HSIL与非HSIL细胞学的AUC均为0.72。

甲基化标志物对进展为肛门癌的预测价值

单变量和多变量Cox分析（调整年龄和HIV状态后）均显示，ZNF582和ASCL1的更高甲基化水平与进展为肛门癌的风险显著相关（HR>1.4, p<0.001）。在预测性能方面，在1年和3年随访时，两个标志物预测癌症的C/D AUC均超过0.79，显示出良好的预测能力。其预测效能（C-index为0.80-0.84）优于HSIL细胞学、hrHPV阳性或HPV16阳性等现有标志物。

基于甲基化标志物定义肛门癌风险阈值

研究者根据3年随访数据确定了风险阈值（ZNF582: 2.24; ASCL1: 2.33，log2[ΔΔCt ratio]）。甲基化水平高于阈值的患者，其进展为癌症的风险显著增加（HR>9, p<0.0001），该关联在多变量分析中依然成立。

本研究通过法国多中心前瞻性队列证实，利用肛门涂片对宿主细胞DNA甲基化标志物ZNF582和ASCL1进行定量检测是可行且可靠的（成功率90%）。在横断面分析中，甲基化水平与细胞学诊断、hrHPV感染状态以及p16/Ki67双染结果显著相关，表明其能有效反映当前病变的严重程度。更重要的是，纵向随访数据首次证明，基线肛门涂片中较高的ZNF582和ASCL1甲基化水平是患者后续进展为肛门癌的独立预测因素，其预测效能优于现有的细胞学或病毒学检测方法。

讨论部分强调，该研究弥补了既往甲基化研究多局限于活检标本和横断面设计的不足，首次在真实世界队列中利用无创性涂片样本验证了这两个标志物的预测价值。尽管本研究对象为有AIN3病史的极高危人群，确定的阈值在此群体中特异性较高（78-85%），但研究者也指出，将其推广至普通高风险人群（如仅hrHPV阳性者）时，需重新定义阈值并开展进一步研究。研究的局限性包括样本以白种人为主、缺乏基线系统性活检金标准对照以及癌症事件数相对较少导致的统计不确定性。

综上所述，本研究为ZNF582和ASCL1甲基化检测作为肛门癌筛查中的分诊工具提供了强有力的循证依据。随着2024年国际筛查指南的更新与HRA资源的持续紧张，此类分子标志物有望整合入未来的筛查流程中：先通过hrHPV检测（高敏感性）初筛，再对阳性者进行甲基化检测（高特异性）以区分真正的高风险人群，最终引导这部分患者接受HRA确诊和治疗，从而优化医疗资源配置，避免过度诊疗，最终实现肛门癌的精准预防和早期干预。