全氟辛酸(PFOA)通过诱导卵巢细胞特异性衰老程序破坏卵泡发育的单细胞研究

本研究针对持久性环境污染物全氟辛酸(PFOA)的卵巢毒性机制，通过建立小鼠暴露模型并结合单细胞转录组测序技术，首次在单细胞分辨率揭示了PFOA通过诱导颗粒细胞和卵丘细胞特异性衰老程序，导致G1期细胞周期阻滞和卵泡耗竭的分子机制，为环境污染物介导的生殖功能障碍提供了新的病理生理学见解。

　　

在现代工业社会中，全氟烷基物质(PFAS)作为一类持久性环境污染物，正日益成为全球公共卫生的重要挑战。其中全氟辛酸(PFOA)因其极端环境稳定性和生物累积性，在95%以上人群血清中均可检测到，对人类生殖健康构成严重威胁。越来越多的流行病学证据表明，PFOA暴露与月经紊乱、生育力下降和早发性卵巢功能不全存在显著关联，但其具体的细胞和分子机制至今尚未在细胞类型分辨率上得到阐明。

传统研究主要依靠组织学或批量组织转录组分析，缺乏在异质性卵巢环境中识别细胞类型特异性反应的分辨率。这种技术限制阻碍了我们对不同卵巢细胞群体如何响应PFOA暴露以及哪些细胞区室表现出特殊脆弱性的全面理解。细胞衰老作为一种永久性细胞周期停滞状态，近年来被认为是生殖衰老和功能障碍的关键因素，但PFOA是否在特定卵巢细胞类型中诱导细胞衰老仍 largely unexplored。

为此，研究人员在《Ecotoxicology and Environmental Safety》发表了创新性研究成果，通过建立PFOA暴露小鼠模型，结合组织学评估、单细胞RNA测序(scRNA-seq)和细胞周期分析，首次在单细胞水平揭示了PFOA诱导卵巢细胞特异性衰老的分子机制。

研究采用雌性ICR小鼠建立PFOA暴露模型(10 mg/kg/天连续灌胃28天)，通过H&E染色进行卵泡定量分析，利用10× Genomics Chromium平台进行单细胞RNA测序，获得超过29,000个细胞转录组数据。通过Seurat软件包进行质量控制、细胞注释和差异表达分析，使用clusterProfiler进行功能富集分析，并整合细胞周期评分与转录组数据来揭示PFOA诱导的细胞周期紊乱机制。

3.1. Effects of PFOA exposure on ovary

组织学检查显示，PFOA暴露组卵巢组织结构紊乱，出现异常空泡形成和细胞排列松散。定量分析表明PFOA组卵巢指数(卵巢湿重/体重比)显著降低。卵泡计数显示PFOA暴露后所有发育阶段的卵泡数量均减少，包括原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡和窦卵泡，同时小鼠体重也显著降低，表明PFOA暴露损害卵巢组织结构并减少各发育阶段的卵泡储备。

3.2. PFOA exposure leads to alterations in ovarian cell populations

单细胞RNA测序分析识别出8个不同的卵巢细胞群体：卵丘细胞(Cmc)、颗粒细胞(Gcs)、成纤维细胞(Fb)、卵泡膜细胞(Tca)、上皮细胞(Epi)、中性粒细胞(Neu)、巨噬细胞(Mac)和内皮细胞(EC)。比较分析发现，PFOA暴露后卵丘细胞显示显著耗竭，表明其对PFOA介导的毒性具有高度脆弱性，而颗粒细胞在实验条件间保持相对稳定的比例，表明卵泡细胞类型间存在差异易感性。

3.3. PFOA exposure induces cell type-specific alterations in ovarian cell senescence dynamics

细胞周期相位分析显示，PFOA暴露后在多个卵巢细胞群体中观察到G1期积累的显著转变。颗粒细胞中G1期表征从64.3%急剧增加至83.4%，同时S期(从21.6%降至4.7%)和G2/M期(从14.1%降至11.9%)相应减少。成纤维细胞、卵丘细胞和卵泡膜细胞也表现出类似的G1期富集模式，表明PFOA暴露主要破坏G1-to-S期转变，导致与早期细胞衰老一致的普遍细胞周期阻滞模式。

3.4. PFOA triggers senescence-associated transcriptional reprogramming in ovarian cells

聚类特异性差异基因表达分析显示，PFOA暴露后多个卵巢细胞类型出现明显的转录变化，卵泡体细胞反应尤为显著。颗粒细胞中细胞周期相关基因显著下调，包括Smc2(log₂FC = -3.71)、H2ac24(log₂FC = -2.25)和Dynll1(log₂FC = -1.62)，同时应激反应机制基因如Igfbp4(log₂FC = 1.13)和Dynap(log₂FC = 4.06)上调。卵丘细胞中关键增殖标志物包括Mki67、Ccnb1和Cdca3显著下调，与细胞周期进展停滞一致。

3.5. Phase-specific transcriptional dysregulation reveals divergent cell senescence control across ovarian cell populations

差异表达基因与已建立的细胞周期相位标志物的重叠分析显示，颗粒细胞中G2/M相关基因广泛失调，包括Rad21、H2ac24和Inhbb的显著下调。G1/S转变调节因子如Ccnd2和Cdca3的改变表明全面的细胞周期检查点破坏。Amh的显著下调表明超出了单纯增殖缺陷的卵泡功能受损。

3.6. Senescence-associated transcriptional profiles vary across ovarian cell types after PFOA exposure

衰老相关基因表达模式分析表明，颗粒细胞中显著的G1期积累与已建立衰老标志物的表达改变相吻合，特别是参与细胞周期停滞、应激反应信号和衰老相关分泌表型调控的基因Smoc2、Cdkn1a和Igfbp4显著上调。卵丘细胞表现出由Aebp1和Hspb1表达升高以及Amh和Nnat下调组成的互补衰老特征，与G1期表征增加并行，表明卵丘-卵母细胞复合体内细胞衰老程序的激活。

研究结论和讨论部分强调，该研究提供了PFOA诱导卵巢毒性的全面单细胞特征描述，揭示了细胞周期阻滞是生殖功能障碍的核心机制。研究表明PFOA暴露显著破坏卵巢结构和功能，表现为所有发育阶段卵泡的显著耗竭、卵泡细胞选择性脆弱性导致的卵巢细胞组成实质性改变、以G1期积累为特征的广泛细胞周期破坏、以及主要影响颗粒细胞、卵丘细胞和基质成纤维细胞的细胞类型特异性衰老相关转录程序的激活。

这些发现挑战了先前关于卵巢对环境毒物均匀反应的假设，并建立了理解差异细胞脆弱性的机制框架。与早期关注较高暴露浓度下急性凋亡的研究不同，该研究表明环境相关浓度的PFOA通过衰老途径触保护性衰老反应而非增殖或凋亡程序，这可能代表了一种随着慢性暴露而变得不适应的适应性机制。

该研究将衰老与代谢破坏的整合与环境毒理学的新兴概念一致。传统研究将氧化应激、炎症和细胞周期破坏作为 distinct pathways，但单细胞方法揭示了它们在衰老程序中的 convergence。这种机制整合解释了早期文献中的明显矛盾，其中PFOA效应因实验条件和检查终点而异。关注急性细胞毒性的研究可能错过了在较低浓度下长期操作的慢性衰老途径。

研究发现还解释了为什么以前的流行病学研究显示PFOA暴露与早发性卵巢功能不全之间存在关联而没有明确的剂量反应关系。如果PFOA主要通过衰老诱导而非直接毒性操作，累积性细胞功能障碍将逐渐显现，一旦衰老细胞负担超过组织修复能力，就会产生生殖结果恶化的阈值效应。这种机制可以解释观察到的PFOA暴露与较早绝经发生之间的关联，这些关联似乎与暴露强度无关。

该研究的衰老发现治疗意义超出了PFOA毒理学范围。最近研究表明senolytic treatments可以逆转年龄相关的生殖衰退，表明通过衰老途径介导的环境毒物效应可能是可逆的。然而，观察到的细胞类型特异性表明治疗方法需要考虑差异脆弱性，而不是应用广泛的干预措施。

该研究建立了细胞衰老作为理解环境毒物对生殖衰老影响的统一机制。通过揭示亚致死PFOA暴露如何通过衰老途径产生持续性细胞功能障碍，研究发现填补了急性毒理学研究与在人群中观察到的慢性生殖健康效应之间的空白。