综述：利用落叶层的可持续生物修复潜力治理多环芳烃污染土壤——综述

《Environmental Pollution and Management》：Harnessing the Sustainable Bioremediation Potential of Leaf Litter for Polycyclic Aromatic Hydrocarbon-Contaminated Soils- A review

多环芳烃（PAHs）的生物降解可通过叶落生物刺激实现，叶落提供碳源、营养及附生微生物，促进PAHs氧化酶活性并改善土壤结构。不同叶种（如橡树、松树、枫树）因C/N比、木质素含量差异影响降解效率，混合叶落可协同降解低、高分子量PAHs。实验室及野外研究表明叶落与生物炭、腐殖质联用可增强降解效果，但需注意营养失衡、 allelopathic效应及长期稳定性问题。

　　多环芳烃（PAHs）是一类具有高度持久性和毒性的有机污染物，广泛存在于受工业活动、化石燃料燃烧和不当废弃物处理影响的土壤中。由于其难以降解的特性以及对生态系统的潜在危害，寻找高效且可持续的修复策略显得尤为重要。本文探讨了叶层（即落叶）作为一种生物刺激剂，在促进微生物介导的PAH降解中的潜力。落叶不仅为微生物活动提供了碳源和营养，还作为附着于植物表面的微生物群落的载体，其中一些微生物具备降解有机物的能力。研究重点包括PAH的化学与物理特性、微生物降解机制以及环境因素对生物降解效率的影响。同时，本文也讨论了不同植物种类落叶的组成、碳氮比、木质素含量等特性如何影响微生物动态、酶活性和养分释放，以及实验室、微生境和实地研究中的实验结果。此外，还考虑了落叶与其他生物刺激剂的协同组合、实际应用策略、季节性供应和可能的限制因素。通过综合分析，本文强调了落叶在生物修复中的多功能性，并指出了未来研究的方向，以优化其在实际环境修复中的应用。通过整合生态学原理和微生物生态学，基于落叶的生物刺激策略为修复PAH污染土壤提供了一种低成本且环境友好的途径。

PAHs的生物降解受多种因素限制，尽管微生物具有广泛的代谢能力。其中，主要限制因素包括生物可利用性低，特别是高分子量PAHs因其高度疏水性，难以被微生物在水相中获取。此外，化学顽固性也影响了降解过程，因为稳定的芳香环结构需要特定的代谢途径才能被分解。营养限制是另一个关键障碍，受污染土壤中缺乏氮、磷和微量元素，会抑制微生物的生长和代谢效率。氧气供应是影响降解效率的重要因素，许多PAH降解细菌是需氧的，依赖于氧气相关的酶（如氧酶）进行初始降解。在厌氧环境中，如水浸土壤或深层沉积物，PAH降解速度较慢且往往不完全。此外，共污染物质（如重金属和其他有机物）可能对微生物群落产生毒性或抑制作用，进一步复杂化降解过程。极端pH值、温度波动、水分不平衡和盐度等环境条件也可能影响微生物的存活和酶的活性。在新污染区域，由于缺乏适应性微生物，降解过程可能受到限制。最后，代谢瓶颈和降解过程中产生的有毒中间产物也可能抑制微生物活性，影响生物降解的效率。

微生物群落是PAH降解的关键参与者，其种类和代谢能力对降解效率具有重要影响。细菌和真菌是主要的降解微生物，它们通过特定的酶系统，如氧酶、细胞色素P450单加氧酶和细胞外木质素降解酶（如漆酶、木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶），将PAHs的持久、疏水结构分解为毒性较低且生物可利用的中间产物。需氧细菌，如假单胞菌、分枝杆菌、鞘氨醇单胞菌、芽孢杆菌、伯克霍尔德氏菌和棒状杆菌，尤其擅长降解高分子量PAHs。其中，分枝杆菌和鞘氨醇单胞菌在降解高分子量PAHs方面表现出色。在厌氧条件下，一些脱氮、硫化物还原和铁还原细菌也能通过替代电子受体和富马酸添加机制进行PAH降解。真菌中，尤其是白腐真菌如赭黑伞菌、变色栓菌和侧耳菌，能够分泌漆酶和过氧化物酶，通过芳香环氧化启动PAH降解。此外，如克洛索菌等真菌能够通过细胞外氧化酶进行芳香烃的转化。酵母菌如Rhodotorula能够缓解氧化应激并降解PAHs，而Cryptococcus则能在湿润环境中生存并通过多种代谢途径转化污染物。这些微生物通过共代谢作用，利用落叶中的易代谢碳源（如实验室中的简单碳源）来驱动PAH氧化酶的表达，并通过菌界间的协同作用，如真菌对复杂有机物的降解为细菌提供底物，反之亦然，促进更广泛的降解网络。此外，水平基因转移在引入的叶面微生物和本土土壤微生物之间传播PAH降解基因（如RHDOs、酚氧化酶），扩大了微生物群落的降解潜力。

落叶作为生物刺激剂，其化学组成和物种特异性特征对微生物降解效率有显著影响。不同树种的落叶具有不同的生化特性，这些特性影响了微生物群落的结构和功能。例如，针叶树如红松的落叶具有高木质素含量（约45%），低氮含量（约0.8%），以及最高的碳氮比，其降解速度较慢，有利于专性降解顽固碳的白腐真菌和放线菌。相比之下，橡树落叶具有中等木质素含量，较低的碳氮比（约35），以及较高的氮含量（约1.2%），促进了早期细菌定殖并维持了真菌过氧化物酶活性。桉树落叶则富含氮但木质素含量较高，尽管降解速度较慢，但一旦木质素降解的微生物群落建立，就能支持强烈的酶活性。而枫树落叶具有较高的碳氮比（约45%），降解速度较快，适合降解低分子量PAHs。此外，落叶的分解过程会释放碳、氮和其他营养物质，刺激微生物的生长，特别是那些能够降解复杂有机物的细菌和真菌，从而增强土壤降解PAHs的能力。

落叶的特定特性，如碳氮比和木质素含量，决定了哪些微生物群落在降解过程中占主导地位。高木质素含量的落叶，如松树或橡树落叶，有利于降解顽固化合物的真菌群落，这些真菌能够逐步分解复杂的分子，包括PAHs。相比之下，碳氮比较低的落叶，如杨树或柚木落叶，更容易被细菌降解，这些细菌在早期降解阶段迅速循环营养，同时启动PAH的降解。此外，落叶还引入了叶面微生物，这些微生物可能携带专门的代谢途径，通过直接代谢或共代谢过程增强PAH的降解能力。引入稀有生物圈微生物（低丰度但具有独特酶活性的微生物）进一步提高了土壤对复杂污染物的降解能力。落叶对微生物多样性和丰度的影响随时间而变化，微生物群落经历了一系列的演替过程。初期，喜养微生物在营养丰富的条件下占据主导地位并加速降解，随着营养变得有限，寡养微生物适应低营养条件并开始降解更复杂的化合物如木质素。这种时间上的变化确保了多种有机污染物，包括PAHs，能够逐步被降解。通过使用扩增子测序技术，如16S rRNA用于细菌和ITS用于真菌，研究人员可以追踪微生物群落的变化，并将其与PAH降解速率相关联，从而深入了解驱动生物修复的机制。

添加落叶后，PAHs的生物降解率提高是由多种机制驱动的：营养丰富、共代谢、酶诱导、pH调节以及吸附动力学的变化。落叶提供了一个富含纤维素、半纤维素、木质素、提取物和必需的大量元素（如N、P）和微量元素（如Fe、Mn、Cu、Zn）的有机基质，支持微生物生物量扩展和能量代谢。随着分解的进行，微生物水解释放简单的糖类、氨基酸和有机酸，这些物质作为共底物刺激异养生长并诱导氧化酶如漆酶、过氧化物酶、单加氧酶和环羟化双加氧酶，这些酶启动了PAHs的环裂解过程。许多落叶具有平衡的碳氮比（10–30），支持分解作用和蛋白质合成，而分解过程中释放的微量元素作为金属酶（如铁依赖的双加氧酶、铜基漆酶）的辅因子，增强了催化效率。共代谢途径通过生成氧化中间体（如醌、环氧、羟基自由基）非特异性地攻击PAH结构，提高其亲水性和生物可利用性。此外，木质素衍生的芳香单体作为酶诱导剂，上调了降解PAHs的酶操纵子，如编码双加氧酶的nahA和xylE基因，这些基因负责启动PAH的羟化反应。这些中间体进一步被儿茶酚双加氧酶处理，进入三羧酸循环，最终完成矿化为CO?和H?O。

真菌和细菌在酶介导的PAH降解中扮演着核心角色。在真菌群落中，变色栓菌和赭黑伞菌分泌木质素降解酶，包括漆酶、木质素过氧化物酶（LiP）和锰过氧化物酶（MnP），这些酶能够分解高分子量PAHs及其结构相似的芳香聚合物。这些真菌在高木质素落叶（如松树、桉树）中表现出更高的活性，因为复杂的碳源能够诱导酶的表达。同时，细菌如假单胞菌和分枝杆菌产生环羟化双加氧酶（如nahA、xylE），这些酶能够氧化PAHs为二氢二醇，这些二氢二醇进一步被儿茶酚双加氧酶处理，进入三羧酸循环。这种跨界的酶协同作用拓宽了催化谱，加速了PAH的矿化。落叶分解过程中释放的木质素衍生单体和类醌化合物作为酶诱导剂，增强了细菌和真菌之间的共代谢作用。

此外，落叶分解改变了土壤化学特性，从而支持这些酶促途径。有机酸（如乙酸、柠檬酸、草酸）轻微酸化土壤，维持了酶活性的最佳pH（6–7），并保持了羟化和环裂解反应的反应动力学。这些酸还能够移动关键的金属辅因子，修改土壤有机质并改善酶-底物相互作用。此外，极性和羧基化的化合物从分解的落叶中释放，将PAHs从土壤颗粒中置换出来，提高其脱附能力。由假单胞菌和Rhodotorula产生的微生物生物表面活性剂进一步乳化PAHs，增加其生物可利用性。

因此，落叶添加能够通过复杂的生化和生态过程提高PAH的生物降解率。通过提供营养、共底物和酶诱导剂，引入多样的微生物群落，调节土壤pH值，以及改变吸附相互作用，落叶作为一种有效的生物刺激剂，在PAH污染土壤中表现出良好的效果。利用这些机制，实践者可以优化生物修复策略，调动本土和引入的微生物群落，并在受污染环境中恢复土壤功能。更多关于“影响营养释放的因素”和“落叶增强的PAH生物降解中的pH调节和吸附效应”的信息可以在补充材料的6.2和8.1小节中找到。

实验数据和案例研究，包括实验室（批次实验、土壤微宇宙）、中型生境和实地研究，提供了落叶作为生物刺激剂在PAH生物降解中的有效性证据。在实验室微宇宙中，富含氮的落叶如雨树、木棉和黄火焰树的叶子被证明能够显著提高PAHs如菲和芘的降解率。Charoenchang等（2003）发现雨树叶子上存在一个高效的菲、芴和芘降解微生物群落，表明这些叶子及其固有的微生物群落可以直接作为生物刺激剂使用。类似地，Siriwarasin（2002）报告称这些落叶在改善PAH降解率方面表现出色，可能归因于其氮含量高以及相关的微生物群落，与高碳氮比的常绿落叶相比，后者通常释放氮缓慢，并可能在初始阶段抑制微生物活性。这些效果归因于落叶的快速分解，释放出可利用的碳（简单糖类、木质素衍生芳香化合物），从而通过共代谢刺激双加氧酶、单加氧酶、漆酶和过氧化物酶的活性。一项为期3至5个月的微宇宙研究显示，堆肥添加显著提高了土壤中13C标记芘的降解率，这与微生物群落结构的变化有关，如通过磷脂脂肪酸（PLFA）分析所显示的。

中型生境研究在半自然土壤柱和水控制的罐中进行，确认了这些趋势。混合落叶促进了微生物多样性的两倍增长和强细菌-真菌合作，导致木质纤维素和PAH的同步降解，尤其是在落叶分解达到高峰时。分子分析显示了已知PAH降解者的丰富，如假单胞菌、鞘氨醇单胞菌和携带nahA和xylE操纵子的白腐真菌。这些微生物相互作用还促进了落叶衍生和本土微生物之间的水平基因转移和共生物膜形成。

实地观察显示，落叶在热带森林生态系统中积极促进PAH的降解和再分配。Wang等（2023）报告称，落叶不仅是PAH的吸收源，还是其降解的场所，季节变化影响了PAH的分配和微生物降解动态。落叶在温暖湿润时期表现出增强的降解潜力，促进了低分子量和高分子量PAHs的减少。相反，实验室分析显示松针落叶的PAH降解率较低，这归因于其顽固的化学组成和微生物的有限可及性；然而，真菌群落在长期暴露条件下表现出适应性。常绿落叶如松树，由于高木质素、树脂和蜡质含量，分解缓慢，导致碳的持续释放和对高分子量PAHs如苯并[a]芘的长期消除。

重要的是，落叶的碳氮比和化学组成调节了其生物修复性能。具有平衡碳氮比（20–30:1）和高易分解碳含量的落叶能够快速刺激异养生长和氧化酶的产生，非常适合快速降解低分子量PAHs。相反，高碳氮比（>40:1）的常绿落叶能够维持长期微生物活性和木质素降解酶的表达，使其适合对顽固化合物进行渐进式修复。中型生境研究和实地试验表明，多样化的落叶组成能够增强生态系统过程。中型生境实验表明，混合落叶增加了微生物多样性并改变了群落组成，导致对分解速率的非加性影响。实地研究显示，混合落叶如橡树和松树能够协同加速落叶分解和养分循环，并能够减少PAHs，这可能归因于互补的养分特征和微生物相互作用。

此外，落叶添加还影响土壤pH值和吸附特性。落叶能够缓冲土壤向中性或轻微酸性条件，这是双加氧酶和漆酶活性的最优pH值。而常绿落叶可能暂时酸化土壤，并增加木质素和PAHs之间的π-π相互作用，使共代谢降解集中在落叶热点。这些化学变化，加上由假单胞菌和Rhodotorula产生的生物表面活性剂，提高了PAHs的脱附和生物可利用性。

因此，使用落叶作为生物刺激剂进行PAH生物修复的成功依赖于对特定土壤质地、组成、气候、土地利用和水文条件的深入了解。落叶的添加策略应根据这些因素进行调整，以确保最佳的修复效果。例如，选择快速分解、富含氮的落叶如枫树和橡树，以应对低分子量PAHs的快速处理，而高木质素常绿落叶如松树则适合长期修复顽固化合物。通过综合考虑这些因素，可以优化落叶的使用，确保快速的初期修复和对持久污染物的长期消除。

在实际应用中，落叶的生物刺激作用需要考虑到季节性供应、环境条件和潜在的生态风险。落叶的使用需要根据具体的土壤类型和环境条件进行调整，以确保其有效性。落叶的季节性供应，如温带地区的落叶在秋季大量可用，提供了一次性的易分解有机物，如纤维素、半纤维素和中等碳氮比，支持微生物繁殖并诱导PAH降解酶的产生。落叶的储存和预处理，如覆盖堆肥或通风堆肥，对于保持其营养完整性、防止厌氧分解至关重要。对于需要持续供应的地点，如常绿落叶的全年供应，可能需要与氮含量较高的材料（如堆肥或绿肥）共堆肥，以增强其降解能力。

尽管落叶作为生物刺激剂在生物修复中的潜力显著，但其实际应用仍面临一些挑战，包括季节性供应、植物毒性效应和养分不平衡。落叶的使用需要根据不同的土壤条件和污染情况选择合适的落叶类型和处理方法。例如，某些落叶含有抗菌的次生代谢产物（如单宁和酚类物质），这些物质在低浓度时可能诱导芳香羟化酶的表达，而在高浓度时可能抑制种子萌发和根系生长，或抑制敏感的PAH降解者。因此，避免使用具有强烈植物毒性作用的落叶，如桉树落叶，可以减少植物毒性并促进微生物多样性。落叶的微生物群落作为土壤中的接种剂，在添加后能够整合到本土微生物群落中，通过水平基因转移促进PAH降解网络的建立。为了提高可重复性和效果，需要标准化落叶的预处理和预分析，如测定木质素、纤维素、总氮和次生代谢产物的含量，进行16S rRNA和ITS测序以映射降解微生物，以及通过粉碎至小于2厘米的尺寸增加表面积，同时控制湿度在30–40%之间，并采用堆肥或干燥程序以稳定营养、减少病原体和调节碳氮比。实验结果表明，混合落叶的方法——结合快速降解的落叶以提供快速的营养脉冲和缓慢降解的常绿落叶以提供持续的碳供应——可以实现不同分子量范围PAHs的协同去除。落叶的选择必须与场地目标相一致：快速处理低分子量PAHs需要选择富含环羟化双加氧酶和漆酶的落叶，如枫树和橡树落叶，而长期消除顽固化合物如苯并[a]芘则需要选择具有持续锰过氧化物酶和木质素过氧化物酶活性的常绿落叶，如松树落叶。地理和季节性因素也进一步优化了落叶的应用：秋季提供丰富的落叶，需要高效的收集、粉碎和储存，以防止厌氧分解；而常绿针叶在全年供应，但可能需要与氮含量高的材料共同堆肥以提高其可降解性。

综上所述，基于落叶的生物刺激策略在PAH生物修复中的应用需要考虑多个因素，包括化学组成、微生物接种、分解动力学、标准化预处理、混合落叶配方和场地特定适应。通过整合这些因素，可以构建一个可靠的框架，使落叶在不同土壤类型和气候条件下大规模应用，确保快速的初期修复和对持久污染物的长期消除。此外，通过GIS和遥感工具，可以有效地规划落叶的来源和优先修复目标，提高生物修复的效率和针对性。同时，长期生态反馈——植物-微生物-土壤相互作用、养分循环轨迹和土壤健康指标——需要通过多年实地试验和结合组学平台进行系统研究。了解重复添加落叶如何改变微生物群落演替、酶诱导（如双加氧酶、漆酶、过氧化物酶）、土壤结构、碳封存和养分流动（N、P、C），将有助于优化添加频率和落叶混合比例，以避免反弹效应或顽固中间产物的积累。此外，试点基于社区的循环经济模型，将市政、公园部门和地方合作社收集、预处理（如粉碎、堆肥）和利用落叶生物量，可以将城市和农村的绿色废弃物转化为低成本的修复资源。这些模型减少了填埋负担和温室气体排放，创造了绿色就业机会，并促进了公众参与污染治理。通过整合本地收集网络、标准化预处理协议和分布式应用方案，社区企业可以确保落叶的稳定供应，满足区域污染挑战。这些策略——场地特定的落叶选择、GIS指导的来源、长期反馈机制的研究以及社区驱动的生物量利用——将最大化不同PAH同系物在不同土壤类型和气候条件下的降解动力学，增强生态系统服务（土壤有机质增强、水分保持、生物多样性支持），并符合全球可持续发展目标，如联合国生态系统恢复十年。通过这种方式，基于落叶的生物刺激可以发展成为一种可扩展、可靠的自然解决方案，用于污染土壤的修复和环境更新。