多维度光谱法解析植物皂苷抑制α-乳白蛋白热聚集机制及其在食品稳定化中的应用

本研究通过多维光谱技术首次揭示五种皂苷（Ts、Gyp、Mog、GA、STE）通过疏水作用与氢键结合α-乳白蛋白（Ala）单体，有效抑制热诱导二硫键交联（重点靶点为Ala6/91/111/120），其中绞股蓝皂苷（Gyp）表现最优异，显著降低聚合物生成并改善粒径/电位/疏水性特性，为热敏感蛋白的稳定化处理提供创新解决方案。

　　

Highlight

本研究首次通过LC-MS/MS蛋白组学技术揭示五种结构差异皂苷在分子水平上对热诱导α-乳白蛋白（Ala）二硫键交联位点的抑制作用机制。

Intermolecular disulfide cross-linking

通过LC-MS/MS分析热诱导Ala与皂苷复合物中的二硫键交联肽段（详见表1），发现所有样本中存在7种常见分子间二硫键交联肽。其中4种为Ala与β-乳球蛋白（β-Lg）的异源交联：β-Lg⁶⁶?Ala¹²⁰、β-Lg⁶⁶?Ala¹¹¹、β-Lg¹⁶⁰?Ala¹²⁰、β-Lg¹⁶⁰?Ala¹¹¹，以及3种Ala同源二聚体交联：Ala⁶?Ala¹²⁰、Ala⁹¹?Ala¹²⁰、Ala¹¹¹?Ala¹²⁰。值得注意的是，皂苷处理显著降低了这些二硫键交联肽的数量（p<0.05），且抑制效果排序为：Gyp > GA > Ts > STE > Mog，与SDS-PAGE及SEC结果高度一致。

Intramolecular disulfide cross-linking

如表2所示，热诱导Ala（H-Ala）中鉴定出12条分子内二硫键交联肽。皂苷处理使Ala-Mog、Ala-STE、Ala-GA、Ala-Ts和Ala-Gyp复合物的分子内二硫键交联肽数量分别显著减少5、6、7、8和10条（p<0.05）。特别值得注意的是，所有皂苷-蛋白复合物中均未检测到涉及Ala⁶、Ala⁹¹、Ala¹¹¹和Ala¹²⁰位点的分子内二硫键，表明这些位点是热诱导二硫键重排中最活跃的反应位点。

Loop disulfide cross-linking

环状二硫键（同一肽段内半胱氨酸形成的二硫键）分析显示（表3），H-Ala中存在4条环状二硫键肽段。皂苷处理显著减少了这类交联（p<0.05），其中Ala-Gyp复合物中仅残留1条，而Ala-Mog复合物中仍保留3条。这表明皂苷通过空间位阻效应抑制了蛋白分子内环状结构的形成。

Secondary structure

如图1A所示，天然Ala的α-螺旋含量为27.3%，经热处理后降至22.4%。与皂苷结合后，所有复合物的α-螺旋含量进一步显著降低（p<0.05），其中Ala-Gyp复合物呈现最低值（18.7%）。相反地，β-折叠含量从天然Ala的19.8%增至H-Ala的23.5%，而皂苷复合物则呈现下降趋势（图1B）。这些变化表明皂苷通过破坏蛋白二级结构抑制了热诱导聚集。

Surface hydrophobicity

如图2所示，天然Ala的表面疏水性为326.7，热处理后飙升至1287.4。所有皂苷复合物均显著降低表面疏水性（p<0.05），其中Ala-Gyp复合物达到最低值（887.5），这与该组最小的粒径分布（后文所述）及最优异的聚集抑制效果高度吻合。

Sulfhydryl group content

游离巯基检测显示（图3），天然Ala含4.27 μmol/g游离巯基，热处理后降至2.13 μmol/g。皂苷复合物组的游离巯基含量显著高于H-Ala组（p<0.05），其中Ala-Gyp组保留最多（3.41 μmol/g），直接证实了皂苷对二硫键形成的抑制作用。

Particle size distribution

粒径分析（图4）显示H-Ala形成大量大尺寸聚集体（主要分布范围1000-10000 nm），而皂苷复合物显著减小粒径（p<0.05）。特别值得注意的是，Ala-Gyp复合物呈现最小的平均粒径（278.9 nm）和最窄的分布区间，这与该组最高的绝对Zeta电位值（后文所述）共同解释了其优异的稳定性。

Zeta potential

如图5所示，所有样品均带负电荷。H-Ala的Zeta电位为-18.7 mV，而皂苷复合物显著增强负电性（p<0.05），其中Ala-Gyp复合物达到最大值（-26.3 mV）。增强的静电斥力有效阻止了蛋白颗粒的聚集，这与粒径分析结果相互印证。

Conclusion

本研究首次通过LC-MS/MS分析揭示了五种结构差异皂苷对热诱导α-乳白蛋白分子内/分子间及环状二硫键交联的抑制机制。结果表明热处理促进二硫键重排，其中Ala⁶、Ala⁹¹、Ala¹¹¹和Ala¹²⁰被确定为最活跃的交联位点。皂苷处理有效减少热诱导Ala中二硫键形成，抑制效果排序为：绞股蓝皂苷（Gyp）> 甘草酸（GA）> 茶皂苷（Ts）> 甜菊苷（STE）> 罗汉果苷V（Mog）。