杏鲍菇对肌原纤维蛋白的冷冻保护作用：速冻猪肉饼冻融循环中理化特性与结构变化的研究

本研究探讨了杏鲍菇(Pleurotus eryngii, PE)在多次冻融(F-T)循环中对猪肉饼肌原纤维蛋白(MP)氧化稳定性和凝胶特性的影响。研究人员通过添加0.5% PE粉末，显著抑制了MP降解，提高了蛋白质溶解度，维持了凝胶白度和持水性(WHC)，并降低了羰基含量和巯基损失。扫描电镜显示PE组形成更致密的网络结构。该研究为天然冷冻保护剂在肉制品保鲜中的应用提供了新思路，对改善冷冻肉制品品质具有重要意义。

　　

在当今食品工业中，冷冻技术是肉制品保存和运输中最常用的方法，它能有效抑制微生物生长和降低酶活性。然而，反复的冷冻和解冻过程会导致冰晶形成和再结晶，改变肌原纤维蛋白(myofibrillar protein, MP)的物理和化学结构，进而引起肉质软化、色泽变差、蛋白质氧化加剧等问题。肌原纤维蛋白作为肌肉组织中的主要功能成分，占总肌肉蛋白质的55-60%，对肉制品的质地、结构和感官品质起着决定性作用。因此，如何减轻冻融循环对肉制品品质的不利影响，成为肉类科学研究的重要焦点。

近年来，各种食品添加剂被广泛应用于冷冻肉制品的加工中。作为一种天然植物来源，食用蘑菇因其健康益处和功能特性而受到越来越多的关注。特别是，食用蘑菇富含蛋白质、膳食纤维、多糖和多酚类物质，使其成为食品应用中很有前景的天然抗氧化剂。杏鲍菇作为一种广泛栽培的重要食用菌，具有很高的营养和药用价值。特别是杏鲍菇的天然冷冻保护特性对肉制品的保鲜具有重要意义。然而，通过添加杏鲍菇来调节冷冻肉制品品质劣变的机制仍不清楚。

为了探究杏鲍菇对猪肉饼MP理化特性的影响，研究人员开展了一项系统研究，相关成果发表在《Food Chemistry: X》上。研究人员通过评估凝胶质量、蛋白质溶解度和浊度等指标，研究了杏鲍菇对冻融循环过程中MP理化特性的影响。此外，还通过MP一级、二级和三级结构的变化来反映MP的结构完整性和改变。

本研究采用了多种关键技术方法。从哈尔滨比优特商业超市采购猪肩颈肉作为实验材料，通过去除可见结缔组织、脂肪组织和筋膜后绞碎制备肉饼。将绞碎的猪肉与12%的冰水和杏鲍菇粉末(0或0.5%)充分混合5分钟形成肉饼，每个重约50克。MP提取采用冷提取缓冲液(10 mM Na₂HPO₄·12H₂O, 10 mM NaH₂PO₄·2H₂O, 1 mol/L EGTA, 0.1 M NaCl, 2 mol/L MgCl₂)(pH 7.0)均质3次，然后在4°C下以3500×g离心10分钟。将获得的沉淀用提取缓冲液(0.1 M NaCl)洗涤3次，再次离心。MP凝胶制备时将MP溶液用PIPES缓冲液稀释至40 mg/mL浓度，在75°C水浴中加热30分钟，然后用冰水冷却至室温。

3.1. 杏鲍菇对MP理化特性的影响

3.1.1. MP浊度和溶解度

浊度是MP聚集的关键指标，反映了蛋白质凝固和粒径大小。随着F-T循环次数的增加，各组的MP浊度显著增加，表明F-T处理加剧了MP的氧化和聚集。与对照组相比，实验组的浊度显著降低(P < 0.05)。这可能归因于杏鲍菇中的生物活性多糖与MP之间形成了范德华力、氢键、疏水相互作用和静电相互作用，共同增强了MP的结构稳定性。

MP溶解度是蛋白质聚集和变性的关键指标，也是表征MP凝胶功能属性的关键参数。随着F-T循环次数的增加，所有样品的MP溶解度均呈下降趋势。值得注意的是，在所有F-T循环中，添加杏鲍菇的样品保持的MP溶解度显著高于对照样品。杏鲍菇富含多糖和多酚类化合物，可以通过与水分子结合充当冷冻保护剂，减少可用于冰晶形成的游离水量，限制冷冻过程中冰晶的生长。

3.1.2. MP zeta电位

MP溶液的电位用于分析MP形成的液滴的净表面电荷。电位绝对值越高，表明液滴间的排斥力越大，系统越稳定。随着F-T循环次数的增加，MP周围的带负电氨基酸发生氧化，导致MP的zeta电位绝对值逐渐降低。经过5次F-T循环后，zeta电位绝对值达到最小值，分别从最初的-3.77 mV和-3.26 mV降至-2.94 mV和-2.15 mV。实验组表现出更高的zeta电位绝对值，表明MP的稳定性和分散性得到改善。

3.1.3. MP粒径分布

粒径是物质大小和聚集的指标，提供了蛋白质聚集程度的直观表示，并影响蛋白质的功能特性。随着F-T循环次数的增加，所有样品的MP平均粒径趋于增大，杏鲍菇处理组的粒径更小，系统更稳定。F-T循环过程中蛋白质间疏水相互作用的加强促进了聚集，从而增大了平均粒径。与对照组相比，实验组的大颗粒数量略少，表明在肉饼中加入杏鲍菇有助于减轻蛋白质聚集。

3.1.4. MP凝胶可视化

MP在加热和冷却后形成凝胶，其表观形态可以直观反映F-T过程中MP的颜色、WHC、组织状态等特征的变化。最初，MP凝胶结构紧密，WHC强。经过多次F-T循环后，凝胶结构逐渐变得松散，WHC明显下降。样品的整体白度下降并变黄，水不断从表面渗出。杏鲍菇延迟了MP凝胶的分裂，不同程度地改善了颜色和WHC。

3.1.5. MP凝胶的白度和持水性

WHC是MP凝胶食用品质的重要指标。F-T循环后，解冻肌肉组织的WHC降低，冷冻储存过程中产生的冰晶破坏了结合水和水合层与蛋白质分子，降低了形成稳定MP凝胶的能力。在所有样品中，WHC均下降，进而降低了凝胶的保水能力。对照组的MP凝胶WHC从77.05%开始，经过5次F-T循环后降至48.67%。在实验组中，WHC从83.81%开始，经过5次F-T循环后降至59.06%。杏鲍菇含有多糖，可以与水分子相互作用，这些多糖可以作为持水剂。

3.1.6. MP凝胶的水分分布

MP的热稳定性是决定肉制品质量和质构的关键因素。低场核磁共振(LF-NMR)技术用于分析凝胶网络中的水迁移和分布，可以准确表征MP的热稳定性，进而为优化肉制品加工工艺和提高其感官特性提供理论依据。添加杏鲍菇在F-T处理开始前提高了MP中结合水的比例。随着F-T循环次数的增加，凝胶的水分布状态不断向更长的弛豫时间移动，表明凝胶的热稳定性和WHC下降。

3.1.7. MP凝胶的微观结构

通过检查这些凝胶的微观结构，可以观察杏鲍菇对其结构特征的影响。在0次F-T循环时，添加杏鲍菇略微减少了凝胶中的孔洞数量。随着F-T循环次数的增加，凝胶微观结构中的孔洞逐渐增多，并逐渐产生更多不规则和更大的孔洞。经过5次F-T循环后，MP凝胶的三维网状结构变得越来越空心和松散。与对照样品相比，含有杏鲍菇粉末的实验组MP凝胶表现出更均匀和有组织的结构，表面更光滑，形成了更连续有序的凝胶结构。

3.2. MP结构特征

3.2.1. MP的一级结构

蛋白质的巯基和羰基含量可以反映蛋白质一级结构的完整性。蛋白质巯基含量的降低和羰基含量的增加与蛋白质氧化的增加呈正相关，表明一级结构持续遭到破坏。重复的F-T循环对MP的结构和构象造成不可逆的损伤，损害蛋白质功能，降低巯基含量并直接氧化氨基酸侧链，从而增加蛋白质羰基含量。

经过多次F-T循环后，MP的羰基含量从1.85 nmol/mg显著增长至11.69 nmol/mg。当添加0.5%的杏鲍菇时，羰基含量从1.72 nmol/mg增加至6.67 nmol/mg。添加0.5%杏鲍菇显著抑制了羰基含量的增加，有效抑制了MP氧化，从而有效破坏了蛋白质氧化链式反应的传播，清除了羟基自由基，防止了羰基的过度积累。

巯基在稳定蛋白质空间结构和维持其理化和功能特性方面起着关键作用。MP含有大量巯基，在MP变性过程中被氧化成二硫键。因此，巯基含量可以作为MP构象特性变化的指标。经过5次循环后，对照组和实验组的巯基含量分别从12.80 nmol/mg和12.85 nmol/mg降至3.16 nmol/mg和10.46 nmol/mg。与对照组相比，实验组的总巯基含量下降幅度较小，表明杏鲍菇在与MP复合时能更好地维持蛋白质的空间结构。

3.2.2. MP的二级结构

经过红外光谱分析，激发肽链的组成酰胺键吸收能量并发生振动。傅里叶变换红外光谱(FTIR)可以反映和测量MP二级结构的变化。这是通过酰胺I区实现的，该区域范围从1600 cm^-1到1700 cm^-1。酰胺I区的改变源于C=O和C-N伸缩振动的贡献。F-T处理持续导致蛋白质的酰胺I带(与β折叠结构相关)向更低频率移动，并发生红移。

在酰胺I带中，对照组的峰在经过五次F-T循环后从1681 cm^-1移至1670 cm^-1，而实验组的峰从1685 cm^-1波动至1674 cm^-1。这意味着添加杏鲍菇使蛋白质的酰胺I带移至更高频率。实验组表现出更强的吸收峰和蓝移，特别是在酰胺的-C=O-区域，该区域在光谱中产生吸收峰。这种偏移可能归因于氢键的断裂和重建，增强了对MP的诱导效应，增加了化学键的力常数，并进一步改变了官能团的结构。

3.2.3. MP的三级结构

荧光光谱通过分析给定蛋白质浓度溶液中色氨酸的淬灭程度，提供了对蛋白质三级结构的见解。当MP折叠时，色氨酸主要存在于蛋白质内部的疏水结构中，导致高荧光强度。然而，当MP部分或完全展开时，色氨酸暴露在蛋白质分子表面，导致更深的淬灭和更低的荧光强度。

在F-T循环过程中，所有样品的荧光强度随着储存时间的延长而逐渐降低，表明蛋白质结构在冷冻和储存过程中受到了一定程度的破坏。与未氧化的MP相比，经过重复F-T循环的样品中MP的荧光强度降低并发生红移，随着F-T循环次数从0增加到5，对照组的最大荧光发射值从339.00 nm移至340.00 nm。这种偏移与氧化诱导的蛋白质三级结构展开有关，其中色氨酸和酪氨酸残基的结合部分屏蔽了荧光发射，而蛋白质的疏水性增加。

与对照组相比，添加杏鲍菇导致MP荧光强度增加和蓝移(杏鲍菇组经过5次F-T循环后的最大荧光发射值为339.60 nm)。实验组的荧光峰在每次F-T循环后始终高于对照组，表明杏鲍菇对MP的氧化具有抑制作用，并最大限度地减少了疏水基团的暴露。这表明杏鲍菇处理组的微环境变得疏水性更强，MP中色氨酸的暴露更少，这减少了内源性色氨酸荧光强度的下降，并且其三级结构更完整。

本研究通过系统实验表明，随着F-T循环次数的增加，MP的浊度、粒径和羰基含量显著增长，而溶解度、白度、WHC和总巯基含量显著下降。重复的F-T循环由于色氨酸残基的暴露而降低了样品的固有荧光强度。补充杏鲍菇的实验组减轻了浊度、粒径和羰基含量的增加，并抑制了MP溶解度、白度、保水性和总巯基含量的下降。这表明添加适量杏鲍菇可以改变MP的质构特性。

这些发现为冷冻肉的保存提供了新的见解，为未来研究杏鲍菇对肉和肉制品的冷冻保护作用提供了宝贵信息。该研究不仅证实了杏鲍菇作为天然冷冻保护剂的有效性，还深入揭示了其作用机制，包括通过多糖和多酚类物质与蛋白质相互作用，稳定MP结构，抑制氧化反应，减少冰晶损伤，从而改善冷冻肉制品的品质特性。未来研究可以在分子水平上探索PE与MP或PE与冰晶之间的特定结合原理，进一步推动天然冷冻保护剂在食品工业中的应用。