来自Pithecellobium dulce（guamúchil）和Inga jinicuil（jinicuil）蛋白质的肽：通过计算机模拟预测并体外验证其抗氧化和抗炎特性

《Food Quality and Preference》：Peptides from Pithecellobium dulce (guamúchil) and Inga jinicuil (jinicuil) proteins: In silico prediction and in vitro validation of their antioxidant and anti-inflammatory properties

豆类抗氧化与抗炎潜力研究：以P. dulce和I. jinicuil种子为例，通过in silico/in vitro模拟胃肠消化，发现其释放的21种肽段含高比例疏水、芳香及带电氨基酸，表现出显著抗氧化和抗炎活性。其中JN的<5kDa组分在ABTS和ORAC测试中抗氧化活性最强（1.77 μmol TE/mg），且通过抑制TNF-α（36.86 ng/mL）和降低ROS水平验证抗炎机制。研究证实未利用豆类种子是可持续开发功能性分子的来源。

　　这篇研究聚焦于两种未被充分利用的豆科植物——*Pithecellobium dulce*（guamúchil，GM）和*Inga jinicuil*（jinicuil，JN）的种子蛋白及其在模拟胃肠道消化后释放的肽片段。研究通过*in silico*（计算机模拟）和*in vitro*（体外实验）两种方法，评估了这些肽片段的抗氧化和抗炎潜力。研究的主要目的是揭示这些植物种子作为健康促进分子的潜在价值，同时为开发基于这些成分的功能性食品和营养补充剂提供科学依据。

### 背景与意义

随着全球对食品安全、营养和公共健康问题的关注不断增加，寻找新的蛋白质来源和生物活性化合物成为科研和工业的重要方向。未被充分利用的豆科植物因其丰富的营养成分和生物活性物质，如黄酮类、皂苷、纤维、蛋白质和生物活性肽，而受到重视。这些植物在原产地具有重要的经济和文化价值，但在全球范围内并未广泛种植或消费。因此，它们的种子常被视为农业副产品，而未被充分开发。

研究指出，生物活性肽具有抗氧化和抗炎特性，这可能有助于预防非传染性疾病（NCDs）。抗氧化机制包括调节活性氧（ROS）水平和促进细胞内抗氧化物质的生成、调节酶活性、金属离子螯合以及与氧化应激相关的信号通路（如Keap1-Nrf2-ARE轴）相互作用。抗炎机制则与调节关键信号通路（如NF-κB和MAPK通路）有关，这些通路控制促炎细胞因子的产生。然而，这些肽分子的具体作用靶点仍需进一步研究。

### 材料与方法

研究从墨西哥的两个地区采集了GM和JN种子，并通过超声波辅助碱性提取法获得种子蛋白提取物。随后，使用液相色谱-质谱联用技术（LC-MS/MS）对提取物进行了蛋白质鉴定，以了解其组成和功能。此外，通过OmicsBox软件对这些蛋白质进行了功能分析，包括基因本体（GO）注释，以确定其参与的生物过程、细胞成分和分子功能。

为了模拟胃肠道消化过程，研究使用了Rapid Peptide Generator（RPG）软件，通过依次消化胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，预测了可能释放的肽片段。随后，利用Peptide Ranker、AnoxPP、AnOxPePred 1.0和PreAIP等工具，评估了这些肽片段的抗氧化和抗炎潜力。同时，通过体外实验，使用ABTS和ORAC方法检测了抗氧化活性，并在小鼠RAW264.7巨噬细胞中评估了抗炎效果，包括对ROS、NO和促炎细胞因子（如TNF-α和IL-6）的影响。

### 结果与讨论

#### 蛋白质组成与功能分析

通过SDS-PAGE分析，研究发现GM和JN种子蛋白提取物的分子量范围分别在11-135 kDa和11-65 kDa之间。GM中观察到高强度的蛋白带，如<11 kDa、16 kDa、60 kDa和65 kDa，而JN则显示出较少的蛋白带，但仍有显著的蛋白质存在。这些结果表明，GM和JN的蛋白质组成具有一定的相似性，但也存在差异。

进一步的质谱分析表明，GM和JN中分别鉴定出20种和22种蛋白质，其中13种为两者共有。这些蛋白质包括多种具有重要生物学功能的成分，如核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶大亚基、线粒体ATP合酶亚基、脂肪酸代谢相关酶和蛋白酶抑制剂。这些成分的存在不仅揭示了其在种子中的重要作用，也暗示了它们可能含有具有生物活性的肽片段。

#### 生物活性肽的预测与鉴定

通过*in silico*方法，研究预测了GM和JN种子蛋白在模拟胃肠道消化后释放的生物活性肽。其中，175种GM衍生肽和181种JN衍生肽被筛选出，具有较高的预测活性。这些肽片段主要包含疏水性、芳香性和带正电荷的氨基酸，这可能与其抗氧化和抗炎特性有关。

研究进一步使用AnOxPePred 1.0和AnOxPP工具预测了这些肽的抗氧化活性，其中WHMPAL、DVAFPPGKMPY和FQGPPHGIQVER等肽具有较高的自由基清除活性。同时，通过PreAIP工具评估了抗炎潜力，发现LMCIRI、RRPPGREAF、DVAFPPGKMPY等肽具有显著的抗炎效果，主要归因于其对NF-κB和MAPK通路的调节作用。

#### 抗氧化与抗炎活性的体外验证

为了验证这些肽片段的生物活性，研究进行了多种体外实验。在ABTS和ORAC检测中，发现JN的<5 kDa肽片段具有显著的自由基清除活性，其抗氧化能力比GM的相应片段高出1.6倍。这表明，低分子量的肽片段在抗氧化方面具有更大的潜力。

在巨噬细胞实验中，JN的<5 kDa肽片段在基础条件和LPS刺激条件下均能有效降低ROS水平和TNF-α的分泌。而GM的>5 kDa肽片段则显示出一定的抗炎活性，通过减少NO的产生和TNF-α的水平。这些结果支持了*in silico*预测，表明这些肽片段在模拟消化后确实具有抗氧化和抗炎特性。

此外，研究还发现，这些肽片段能够增强巨噬细胞的吞噬能力，这可能与其调节免疫反应有关。吞噬能力的增强有助于宿主防御，同时也可能影响炎症的发展。

#### 抗氧化与抗炎机制探讨

研究指出，抗氧化活性主要依赖于肽片段的氨基酸组成，特别是疏水性、芳香性和带正电荷的氨基酸。这些氨基酸能够通过质子供体机制与自由基反应，从而发挥抗氧化作用。同时，低分子量肽由于其结构的简单性和高暴露率，能够更有效地清除自由基。

在抗炎方面，研究发现这些肽片段能够通过调节NF-κB和MAPK通路，减少促炎细胞因子的产生。NF-κB通路在炎症反应中起着关键作用，而MAPK通路则与细胞应激和凋亡有关。通过抑制这些通路的过度激活，肽片段可能有助于减轻炎症反应，从而预防与炎症相关的疾病。

### 结论

本研究首次通过功能蛋白质组学分析，揭示了GM和JN种子蛋白的组成及其在模拟胃肠道消化后释放的生物活性肽。这些肽片段具有显著的抗氧化和抗炎潜力，主要归因于其氨基酸组成和结构特性。研究结果表明，GM和JN种子可能是开发功能性食品和营养补充剂的重要资源，尤其在预防与氧化应激和炎症相关的非传染性疾病方面具有应用前景。

此外，研究还强调了这些未被充分利用的豆科植物在农业和食品工业中的潜在价值。通过科学手段，可以将这些副产品转化为高价值的健康产品，促进其在当地的可持续利用。未来的研究应进一步探讨这些肽片段如何调节炎症和抗氧化相关信号通路，以更深入地理解其作用机制，并为实际应用提供理论支持。

### 作者贡献与资金支持

本研究由C. Valencia-Olivares、G. Franca-Oliveira、D.A. Luna-Vital和B. Hernández-Ledesma共同完成。C. Valencia-Olivares负责撰写原始草稿、研究和数据分析；G. Franca-Oliveira参与研究和数据分析；D.A. Luna-Vital负责审阅和编辑稿件，以及项目资金获取和概念设计；B. Hernández-Ledesma负责审阅和编辑稿件，监督研究进程，管理项目并获取资金支持。

研究得到了Tecnológico de Monterrey-Institute for Obesity Research和CSIC的资助，同时部分研究人员还获得了其他机构的奖学金和研究资助，以支持其在该领域的进一步探索。

### 未引用参考文献

尽管研究引用了大量文献，但仍有部分相关研究未被提及，这可能限制了某些研究结果的全面性。未来的研究应更全面地参考这些文献，以确保对研究领域的充分理解。此外，进一步的实验和临床研究将有助于验证这些肽片段的实际效果，并推动其在健康产品中的应用。