乳制品中单核细胞增生李斯特菌的快速筛查与检测：一种新型两阶段酶底物法的开发与应用

本文开发了一种新型两阶段酶底物检测法（Two-Stage Enzyme Assay），用于牛奶及乳制品中单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）的快速、特异性检测。该方法通过李斯特菌选择性富集培养基（LSEM）和酶底物培养基（ESM）分步实现靶向富集与代谢确认，检测限低至1.35 log cfu/mL，可在28小时内完成检测，显著优于传统ISO 11290-1:2017方法，为复杂乳基质中的病原体监测提供了高效、经济的解决方案。

　　

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Bacterial culture and maintenance of culture

本研究使用的所有菌株均来自权威保藏中心，包括单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes15303, ATCC）、伊氏李斯特菌（L. ivanovii19119, ATCC）、无害李斯特菌（L. innocua, ATCC）、粪肠球菌（Enterococcus faecalis, ATCC）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus9144, ATCC）、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus14569, ATCC）、沙门氏菌（Salmonella abony）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）、产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes）、干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）和发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）。通过特定选择性培养基划线并于37°C培养24小时，确保菌株纯度。

Detection of Listeria monocytogenesusing Two stage assay

两阶段检测法中，第一阶段使用李斯特菌选择性富集培养基（LSEM）富集李斯特菌属，同时抑制乳制品中的背景微生物。在低接种量（约1.4 log CFU/mL）下，L. monocytogenes、L. innocua和 L. ivanovii凭借β-D-葡萄糖苷酶活性在24小时内持续产生黑色显色反应（图2B）。第二阶段通过酶底物培养基（ESM）进行代谢确认，L. monocytogenes在3-4小时内产生特征性绿色，实现快速鉴定。

Conclusion

两阶段酶法检测通过LSEM靶向富集与早期检测，结合ESM快速代谢确认，可在约28-30小时内可靠鉴定牛奶和乳制品中的单核细胞增生李斯特菌，速度快于ISO 11290-1:2017方法。该方法检测限约1.35 log cfu/mL，且能强效抑制非目标菌，即使在高污染样本中仍保证准确性。现场验证表明其适用于乳品安全监测与法规筛查。